基因敲除在雌性小鼠生殖系统研究中的应用

秦智娟，杨晓清，张玉泉

·综述·

基因敲除在雌性小鼠生殖系统研究中的应用

秦智娟，杨晓清，张玉泉△

【摘要】基因敲除技术是20世纪80年代后半期应用DNA同源重组技术发展起来的，在对基因功能、发育生物学和疾病的研究中发挥了重要作用。直到现在，运用同源重组实现基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍最经典的方法。基因敲除动物模型中应用最广泛的是基因敲除小鼠模型。综述目前国内外实现基因敲除的几种重要方法以及利用同源重组实现的基因敲除技术在雌性小鼠生殖系统研究中的应用。这些应用主要包括研究性激素对生殖器官及激素依赖性疾病的影响、细胞分泌因子在发育期调控生殖器官组织的机制及胚胎形成后的性腺发育与成熟缺陷等。

【关键词】小鼠,基因敲除；泌尿生殖系统；DNA，重组；诱变，插入；RNA干扰

（J Int Reprod Health/Fam Plan，2016，35：51-55）

科学家们运用分子生物学方法改变动物体内某一特定基因制成基因敲除的动物模型，可以为人类探究疾病发病的分子机制、病理特征及诊疗方法等提供良好的实验模型。基因敲除的建立需要克服各种技术困难，如DNA的分离、质粒构建及同源重组效率等。过去比较熟悉的基因敲除方法有3种：同源重组法、插入突变法、RNA干扰（RNA interference，RNAi）法。近些年来一些创新性的基因敲除技术也备受国际关注，如锌指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）基因打靶技术、转录激活因子样效应物核酸酶（transcription activator -like effector nucleases，TALENs）基因敲除以及一种全新的基因编辑技术CRISPR/Cas9 [clusteredregularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated 9]。虽然基因敲除的方法多种，且近两年CRISPR/Cas9技术已被国外不少科学家视为未来承担细胞基因研究重任的领头羊，但目前为止用于研究基因生物学功能的小鼠基因敲除模型仍大多依赖同源重组法。

1　基因敲除方法

1.1同源重组法同源重组又叫基因打靶技术，是目前基因敲除技术中的金标准。同源重组法是以打靶载体质粒和胚胎干细胞（简称ES细胞）技术为基础，通过DNA同源重组使特定基因失活。基因敲除载体是根据需敲除基因序列的特点设计的含有2个筛选标记基因和特定基因同源臂序列的克隆载体，载体的构建是基因打靶技术的核心。将该载体通过电穿孔法或显微注射法导入同源的ES细胞中，使敲除载体与ES细胞核基因组定点发生同源重组，将载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。大多以新霉素（Neo）抗性基因作为阳性筛选标记基因，阴性筛选标记基因目前最常用的是白喉毒素A亚基（Diphtheria Toxin Subinit A，DTA），DTA位于同源序列之外不参与同源重组[1]。在随机插入的情况下，如果有DTA表达，DTA能够直接杀死ES细胞，保证只有发生同源重组的ES细胞才能在含G418的培养基中存活。将正负筛选发生同源重组的阳性克隆细胞体外扩增，通过囊胚显微注射法获得嵌合体胚胎。再将此嵌合体胚胎植入假孕小鼠子宫内，使其发育成嵌合鼠，嵌合鼠与正常小鼠交配得到的后代再进行筛选。

基因敲除技术又可以分为完全基因敲除和条件型基因敲除。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性，条件型基因敲除则通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除，主要应用于胚胎致死基因的研究。源自噬菌体P1的Cre/Loxp和来自酵母的FLp/Frt系统是条件型基因敲除的关键[2]。将被同向Loxp序列标记的阳性鼠与特定组织的重组酶Cre工具鼠交配，重组酶Cre根据各启动子的时空特异性可在特定发育阶段或特定组织细胞中将两个同向Loxp位点之间的DNA片段敲除，从而实现对目的基因不同位置或不同程度的修饰。这一方法使研究某个基因在特定组织器官中的生理学功能成为可能。

1.2插入突变法插入突变是指利用某些能随机插入DNA序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞的基因组中进行随机插入，诱发目的基因发生突变[3]。随机插入突变可以分为T-DNA插入突变和转座子插入突变，两者都是在植物中广泛应用的基因敲除手段，在动物模型构建中运用较少。

1.3RNAi法RNAi是通过双链RNA（dsRNA）介导特异性地降解相应序列的mRNA，导致转录水平或转录水平后的特定基因沉默。dsRNA在Dicer酶的作用下可产生一系列特定长度的小干扰RNA （siRNA），siRNA分子、核酸酶以及螺旋酶等结合形成RNA诱导沉默复合物，这种复合物以三磷酸腺苷（ATP）依赖的方式催化双链siRNA解旋，单链siRNA通过碱基配对识别与之互补的靶RNA，切割靶RNA，并由RNA酶降解，从而导致靶基因的沉默。RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中，可抑制单个基因、基因家族甚至整个基因组的基因表达，具有特异性强、效率高、穿透性强等优点[4]。但RNAi也有其局限性，其不能应用于所有的基因和细胞类型，且存在位置效应和不完全敲除等弊端，因此不能替代传统的同源重组技术。

1.4ZFN基因打靶技术ZFN是一种人工改造的核酸内切酶，由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶具备剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。DNA识别域由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，从而达到DNA定点剪切的目的[5]。ZFNs介导的基因敲除，可以精确地修饰基因或其周围的调控元件，通过原核注射或胞质注射得到基因敲除动物，为研究人类疾病构建良好的动物模型。

1.5TALENs基因敲除转录激活因子样效应物核酸酶是第二种人工核酸酶，TALENs与ZFNs有相似之处，其构建是基于植物病原体黄单胞菌分泌的一种转录激活子样效应因子TALE可以识别DNA序列的原理[6]。TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核苷酸序列有恒定的对应关系，由34个氨基酸重复序列组成一个单元，34个氨基酸中的第12和13个氨基酸对应识别1个目标碱基。TALEN系统利用FokI的内切酶活性干扰目标基因，TALE蛋白中的DNA结合域与FokI核酸内切酶的切割域融合，在特异位点切断目的基因序列。TALENs解决了ZENs方法不能识别某些目标基因序列及识别序列易受上下游序列影响等问题，无基因序列、细胞、物种的限制，使基因操作变得更加简便，但目前该技术难度较大，敲除效率也有待提高。

1.6CRISPR/Cas9基因敲除2013年初，由于第3种人工核酸内切酶Cas9的出现，一种创新性的由RNA介导Cas核酸酶对靶基因进行特定DNA修饰的技术正日益成熟[7]。CRISPR是在细菌和古细菌中广泛存在的成簇的、有规律的、间隔的短回文重复序列。2007年，Barrangou等[8]首次发现并证明细菌可能利用CRISPR系统抵抗噬菌体入侵；2008年，Marraffini 等[9]又发现细菌CRISPR系统可阻止外源质粒的转移，其是细菌的一种获得性免疫系统。CRISPR衍生出的RNA（CRISPR-derived RNA，crRNA）通过碱基配对与反式激活RNA（trans-activating RNA，tracrRNA）结合形成特定的复合物，该复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点处切割双链DNA。通过人工设计这两种RNA，可改造形成具有引导作用的RNA（guide RNA），引导Cas9对DNA实行定点切割。作为一种RNA引导的dsDNA结合蛋白，Cas9核酸酶能够共定位RNA、DNA和蛋白。CRISPR/ Cas9可以同时在同一ES细胞中的多个位点实现多靶点同时酶切，使多个基因敲除成为可能[10]，目前使CRISPR/Cas9技术受限的主要原因是其具有严重的脱靶性。该技术的产生预示着在未来几年内，动植物发育、干细胞定向分化、遗传疾病定点修复等都将得到迅猛的发展。

2　基因敲除模型在雌性小鼠生殖系统研究中的应用

2.1生殖相关激素及其受体敲除同源重组法的载体构建及验证步骤[以卵泡刺激素β（FSHβ）为例]：从特定的细菌人工染色体中分离出FSHβ基因并进行克隆，通过基因测序证实为FSHβ基因。根据FSHβ基因序列的特点，敲除外显子1和外显子2以及大部分的外显子3约2.3 kb的区域。然后构建一个打靶载体，包括分别与FSHβ基因5′端和3′端的部分区域同源的基因组序列，正选择标记基因（如新霉素耐药基因）插入目的基因片段中，负选择标记基因（如单纯疱疹病毒胸苷激酶、DTA等）连接于载体末端。在线性化位点将载体线性化后，将其导入胚胎干细胞中进行同源重组和克隆筛选[11]。最终可通过聚合酶链反应（PCR）及DNA印迹（Southern blot）实验证实干扰片段导入成功。

2.1.1FSH和黄体生成激素（LH）研究发现，FSH完全敲除的雌性小鼠由于卵泡在腔前期就已停止发育而不具备生育功能，子宫变得细小，组织学检查呈萎缩状态[12]。FSH参与调节细胞色素P450 19组A组多肽1芳香化酶（Cyp19a1），该酶主要参与卵巢颗粒细胞分泌雌激素的过程；PCR实验发现FSH敲除鼠Cyp19a1的表达受抑制，雌激素表达明显下降。FSH敲除鼠在生殖系统的诸多缺陷是显而易见的，现在不少研究者正利用转基因动物模型构建FSHβ过表达小鼠来修复FSH敲除鼠在生殖系统中表现出来的各种缺陷[13]，从正反面验证FSH在生殖系统中的重要作用。LH敲除的雌鼠性腺机能减退也不具有生育能力，组织学检查显示LH敲除鼠含有退化的卵母细胞的基础卵泡发育异常，部分初级卵泡和次级卵泡形成正常，排卵期前卵泡及黄体形成受损，雌孕激素的表达均明显下降，子宫内膜变薄，子宫发育明显不良。行为学观察发现小鼠的发情周期紊乱[14]。由此可见，FSH和LH在卵泡形成时有其各自特定的功能，不可替代，它们对于生殖系统的形成和发育均至关重要，缺一不可。

2.1.2雌激素受体（ER）ER包括ERα和ERβ，主要在生殖系统、神经系统及骨组织中高表达。ERα敲除雌鼠子宫内膜形成较薄，卵巢未见黄体，生育能力缺失，免疫组化结果显示泌乳素（PRL）减少，而LH 和FSH细胞表达增加[12]。行为学观察表明ERβ敲除小鼠性行为正常，雌鼠生育功能受损，但仍有生育可能；与野生小鼠相比，ERβ基因敲除小鼠的子宫在组织学方面未见异常。ERα和ERβ基因共敲除的小鼠不孕，生殖道发育无异常，雌鼠出生后卵巢发生性逆转，卵泡分化转变成类似睾丸的输精管结构[13]。间接表明ER对于保持卵巢中干细胞和体细胞的活性不可或缺，在维持动物性腺的正常功能中发挥着重要作用。

2.1.3孕激素受体（PR）PR是一种核受体因子，在排卵过程中至关重要。分为2种亚型：PR-A和PR-B，两者在介导与调节卵巢、子宫和乳腺的功能及生殖活动中起关键作用。将这2种受体基因共敲除可导致整个生殖系统出现病变[15]。PR敲除的雌性小鼠组织学检查显示卵泡发育不良、子宫内膜炎症、子宫畸形、乳腺发育受阻，与野生型鼠相比，LH和PRL表达增加。还有研究显示，PR基因敲除鼠中降解和伴血栓形成样金属蛋白酶-1和组织蛋白酶L表达异常[16]，这两种蛋白酶可与PR结合，在卵泡破裂中发挥关键作用。

2.1.4垂体PRL垂体PRL及其受体是哺乳动物生殖系统中的关键调节者。PRL敲除的雌鼠表现为多方面的生殖缺陷，如不孕，不规则的发情周期，血LH 及FSH表达降低。同FSH一样，也有学者利用高泌乳素（hyper-prolactinemia，hPRL）转基因鼠来提高PRL敲除鼠体内的PRL水平，观察敲除鼠的生殖系统是否得到修复，结果显示PRL基因敲除鼠与hPRL转基因鼠交配后可正常生育[17]。PRL受体敲除鼠怀孕后，黄体不能产生孕激素维持妊娠，使胚胎着床失败，但注入外源性孕激素后胚胎着床和胚胎发育均可恢复正常。

2.1.5催产素（OXT）OXT可刺激乳腺导管肌上皮细胞收缩，促进乳汁分泌和子宫收缩，调节子宫前列腺素的释放及黄体的功能。OXT基因敲除鼠仍具有生育能力，性行为和母性行为正常，但失去泌乳能力，社会行为异常，表现为抑郁倾向[18]。还有研究发现，正常的雌鼠可通过识别特殊气味来选择没有寄生虫感染的雄鼠进行交配，从而减少寄生虫的传播，而OXT敲除鼠识别能力受损，嗅觉和学习功能均正常，具体相关机制仍不清楚[19]。OXT敲除的雌鼠分娩后无乳汁分泌，而静脉注入OXT后泌乳行为正常，暗示OXT可能通过某一机制刺激PRL分泌增加[20]。野生型及OXT敲除鼠持续注入OXT的研究表明，低浓度OXT使分娩延迟，同时血孕激素浓度下降也延迟；而高浓度OTX利于分娩。

2.2其他生殖相关因子的敲除

2.2.1白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）LIF可调节着床必需的限速酶，LIF缺失的小鼠胚泡着床周围的子宫内膜中血管内皮生长因子及环氧合酶2（COX-2）表达紊乱导致着床失败，而表达LIF的小鼠子宫内膜可能通过释放信号，调节相关因子、激素以及酶的释放来促进着床。LIF敲除实验已证实，LIF是小鼠胚胎着床的必要因子[21]。LIF纯合子敲除雌鼠分别与LIF纯合子敲除雄鼠及野生雄鼠交配后均有受精卵形成并可发育至正常胚泡阶段，但不能着床。而将这两种胚泡移植入正常雌鼠的宫腔内均可妊娠并继续发育。表明LIF对胚胎发育不是绝对必需的，不过LIF缺陷胚胎的质量和体积均比杂合胚胎小，提示LIF可能作为胚胎营养因子促进胚胎发育[22]。说明LIF基因突变也可能是不明原因不孕及体外受精-胚胎移植后着床失败的重要原因之一。

2.2.2SMAD蛋白SMAD是近几年发现的转化生长因子β（TGF-β）超家族的细胞内信号转导分子，该家族成员众多。SMAD3的敲除使卵泡增长变缓，特点是卵泡直径小、低增殖细胞核抗原水平及低细胞周期基因的表达。此外，SMAD3敲除雌鼠卵泡分化受影响，ERβ的表达减少增加了ERα的表达，同时抑制素的表达也减少。说明SMAD3敲除鼠卵泡形成受损与改变基因的表达有关，如控制细胞周期进展、细胞生存和细胞分化。SMAD3不足也导致雌二醇水平降低和FSH水平升高。SMAD3敲除鼠的卵巢没有黄体，其在伴有外源性促性腺激素的排卵反应下仍没有排卵发生。这些研究表明小鼠生育能力下降。SMAD3敲除鼠卵泡生长受损，阴道闭锁，高FSH水平及FSHR的正常表达，细胞周期蛋白D2低表达，均提示在小鼠卵巢内可能存在着SMAD3与FSH及FSHR下游信号之间的互动[23]。SMAD4卵巢条件性敲除鼠卵泡形成受阻，卵巢发育不良，生育能力受损。类固醇的调节被破坏，血中类固醇水平增加，卵丘细胞严重缺乏，这些发现说明，通过干扰SMAD4在卵巢颗粒细胞的信号，最终导致黄体化颗粒细胞形成过早和卵巢功能早衰，暗示TGF-β超家族信号通路是在体内卵巢颗粒细胞分化的时机扮演关键的角色[24-25]。SMAD家族其他成员也参与生殖系统的形成与发育，现正在进一步研究中。

2.2.3变性基因叉头框L2基因（forehead box L2，FOXL2）是第1个被认定在维持卵巢功能方面发挥重要作用的人类常染色体基因。FOXL2基因位于细胞核内，是一个2.7 kb的单外显子基因，位于3q23区域。这个藏在人类体内的“变性基因”可以让人类保持性别特征，但如果FOXL2出现异常，女性身体则有可能长出男性的睾丸及胡子。小鼠的基因表达研究表明FOXL2表达仅限于发育中的眼睑、卵巢颗粒细胞及垂体促甲状腺及促性腺细胞。其局部表达的缺失可导致双眼睑的发育异常。FOXL2的完全性敲除显示颅面（眼睑）的缺失，卵泡形成受损及围生期致死率高[26]。利用Cre/Loxp技术敲除小鼠促性腺组织中的FOXL2，发现雌鼠及雄鼠FSH合成明显减少，且由于排卵减少，精子形成受阻，生育能力较低[27]，表明FOXL2是体内FSH合成至关重要的且细胞自发性的调节器。

2.2.4激活素样激酶2（activin-like kinase 2，ALK2）ALK2条件性敲除鼠的相关研究表明，ALK2虽然不是胚胎植入时的必需分子，但其在胚胎植入后子宫基质蜕膜化过程中极为重要，在子宫内敲除该分子后妊娠小鼠蜕膜形成受阻[28]。尽管ALK2与骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）不是唯一的配体与受体，将BMP2条件性敲除后也会干扰妊娠小鼠蜕膜形成[29]。

2.2.5自噬相关基因正常小鼠在卵巢内可诱发自噬反应，自噬系统可保护初生鼠卵巢中的生殖细胞过度丢失。最近研究发现，生殖细胞特异性自噬相关基因7（autophagy-related gene 7，Atg7）敲除鼠体内的自噬反应被破坏后，在新生儿过渡期卵母细胞则丢失过多[30]，由于卵巢的发育不良导致小鼠生育能力低下。

3　问题与展望

可以看出，基因敲除技术近些年来得到了迅猛发展，而基因敲除在生殖系统中的应用也将会是未来研究的热点。敲除的生殖激素及相关分子不但对生殖系统的发育及胚胎形成至关重要，对一些妇科性腺激素依赖性疾病如子宫肌瘤、子宫内膜异位症及一些妇科恶性肿瘤等也有一定的影响。目前基因敲除技术应用于生殖系统的研究仍不够广泛，未来可以将生殖激素、受体基因以及参与生殖发育的相关因子部分或完全敲除来进行一系列系统性实验，构建参与生殖系统组成的分子网络，并寻找有效的基因修复方法逆转生殖缺陷，可更明确地了解这些分子的生物学功能及其在不同疾病中的作用机制，对研究生殖系统发育异常及激素依赖性疾病的发生机制具有重要意义。

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[本文编辑王琳]

Application of Knockout Female Mice in Reproductive System Research

QIN Zhi-juan，YANG Xiao-qing，ZHANG Yu-quan.
Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001，Jiangsu Province，China
Corresponding author：ZHANG Yu-quan，E-mail：jsnt_zhangyuquan@163.com

【Abstract】Gene knockout technology was developed in the second half of the 1980s through the homologous recombinant DNA technology, which played an important role in the research of gene function, developmental biology and diseases. Until now, the homologous recombination DNA technology is still the most popular way to build the knockout models. The knockout mice model has been most widely used. This article mainly reviews some important methods of gene knockout at home and abroad and their application in the study of female reproductive system, including the influence of sex hormone on reproductive organs and hormone -dependent diseases, the mechanisms of cytokines in the regulation of reproductive organs during puberty and gonad development and mature, as well as the defect in the gonadal development of embryo.

【Keywords】Mice，knockout；Urogenitalsystem；DNA，recombinant；Mutagenesis，insertional；RNAinterference

基金项目：国家自然科学基金面上项目（81370677）

作者单位：226001南通大学附属医院妇产科

通信作者：张玉泉，E-mail：jsnt_zhangyuquan@163.com△审校者

收稿日期：（2015-07-30）