血管内皮生长因子与牙发生发育的关系

侯丽雯　焦婷　谢明

上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科，上海市口腔医学重点实验室　上海 200011

血管内皮生长因子与牙发生发育的关系

侯丽雯焦婷谢明

上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科，上海市口腔医学重点实验室上海 200011

血管内皮生长因子（VEGF）不仅在促进血管内皮细胞分裂与增殖、胚胎发生发育、创伤愈合中发挥着重要的作用，而且在骨的生成与改建过程中，成骨细胞来源的VEGF作用于破骨细胞分化使破骨细胞发生趋化，使局部破骨细胞数目增加并促进局部骨吸收。上皮组织与外胚间叶组织的互相作用贯穿于牙胚发生发育到牙体组织形成的整个过程，内外釉上皮细胞与牙乳头细胞分泌的VEGF及其受体互相作用，促进成釉细胞与成牙本质细胞的分化成熟，影响釉质与牙本质的形成。许多与牙发生相关的基因表达于牙胚中央的釉结中，这些基因涉及的信号转导通路也参与牙的发生。VEGF基因表达受到无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族/β-连环蛋白信号转导通路的调控。目前，有关VEGF和VEGFR在牙胚发生发育中的认识仅仅停留在表观层面，对于功能及调控机制有待深入的研究。

血管内皮生长因子；牙发生；骨生成

［Abstract］Vascular endothelial growth factor（VEGF） is not only involved in promoting vascular endothelial cell division and proliferation but also plays an important role in development，wound healing and bone formation and remodeling. Osteoblasts derived from VEGF are differentiated from osteoclasts through chemotaxis，resulting in increased number of local osteoclasts and enhanced local bone absorption. The interaction between epithelial and ecto mesenchymal tissues through the development of tooth germ occurs during dentin formation. The inner and outer enamel epithelia and dental papilla cells secrete VEGF and interact with its receptor，thereby promoting ameloblasts into odontoblast differentiation and maturation and influencing the formation of dentin and enamel. Genes involved in tooth occurrence are expressed in the enamel knot at the center of the tooth germ. Moreover，the signal transduction pathways associated with these genes are involved in tooth occurrence. VEGF gene expression is regulated by wingless-type mice mammary tumor virus integration site family/β-chain protein signal transduction pathway. Currently，the roles of VEGF and VEGFR in the development of tooth germ are only elucidated at the superficial level，and their functions and regulatory mechanism must be further investigated.

［Key words］vascular endothelial growth factor；odontogenesis；osteogenesis

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）起初是从牛垂体滤泡星状细胞的体外培养液中纯化提取的一种特异性作用于血管内皮细胞的糖蛋白，可促进血管内皮细胞的有丝分裂和迁移，从而促进血管形成［1］。VEGF是由二硫键连接而成的同源二聚体糖蛋白，是一种多功能的细胞因子，等电点为8.5，对热和酸稳定，对血管内皮细胞具有特异性的肝素结合能力。VEGF属于血小板衍生生长因子家族成员之一，可由内皮细胞、平滑肌细胞以及一些间质细胞分泌。现有VEGF家族成员包括VEGFA～E以及胎盘生长因子6个亚型。血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）家族有VEGFR1～3，分别由fms样酪氨酸激酶受体（fms-like tyrosine receptor，FLT）1、胎肝激酶（etal liver kinase，FLK）1-激酶结构域插入区（kinase domain region，KDR）和FLT4基因编码［2］。每个VEGF亚型特异性地与VEGFR的特定组合结合。VEGFA在组织和细胞中质量最丰富，故多数文献中的VEGF即指VEGFA。

1　VEGF

VEGF在促进血管内皮细胞分裂与增殖、胚胎发生发育、创伤愈合中发挥着重要的作用，其在骨的生成与改建中的研究取得了一定的成果。

Liu等［3］仅在小鼠的成骨细胞谱系细胞中敲除Vegf基因，小鼠表现出骨量减少与骨髓脂肪增加的现象，这不禁使人产生VEGF或VEGF信号转导通路能否用于靶向治疗骨质疏松症的疑问。进一步的研究显示，VEGF通过作用于破骨细胞上的VEGFR，由胞内分泌和旁分泌作用调节骨的动态平衡。VEGF刺激成骨细胞分化并通过胞内分泌功能抑制脂肪细胞分化。成骨细胞来源的VEGF发挥旁分泌作用于破骨细胞使破骨细胞发生趋化，可以使局部破骨细胞数目增加，从而促进局部骨吸收［4］。围绝经期后妇女产生的VEGF的多少被报道可能与腰椎骨矿物质密度的高低相关，但是没有确切的证据表明外周循环中的VEGF的质量浓度与骨矿物质密度有明显的关联。对于这一现象Costa等［5］以为，可能与VEGF仅通过胞内分泌的机制刺激成骨细胞分化及抑制脂肪细胞分化有关，并非通过旁分泌途径。

VEGF除了作用于血管内皮细胞和成骨生成及改建的相关细胞外，还在其他类型的细胞中发挥作用。譬如VEGFA可以刺激单核细胞和巨噬细胞的移动趋化［6］，VEGFC参与大鼠前脑的视网膜神经系统的发生及功能运作［7］，VEGFC和VEGFD也共同参与支气管周围的淋巴系统的发生发育［8］。VEGFR主要在内皮细胞中表达，除VEGFR3分布于淋巴内皮细胞外，VEGFR1和VEGFR2主要在血管内皮细胞中表达。VEGFR1可以在肾小球系膜细胞、单核细胞和滋养层细胞中表达，VEGFR2可以在造血干细胞、巨噬细胞和视网膜前体细胞中表达［9］。

2　VEGF在牙发生发育过程中的表达及作用机制

近年来，通过实时定量荧光聚合酶链反应和免疫组织化学染色等技术，VEGFA、C、D，VEGFR2、VEGFR3已陆续在小鼠和人的牙胚发生中被检出。譬如Vegf mRNA及其上游调控因子蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）1和Pkc2 mRNA共同表达，经时性地上调于大鼠帽状期和钟状期的牙胚内釉上皮之中［10］。VEGFC、D和VEGFR3蛋白表达于小鼠胎龄14 d（蕾状期）和17 d（钟状期）的牙源性上皮细胞、外胚间叶细胞、内釉上皮细胞和牙乳头细胞中［11］。在锁骨颅骨发生不全综合征患者（核心结合因子-α1基因缺失）的牙髓细胞中，VEGFA mRNA、VEGFB mRNA、VEGFC mRNA的表达较健康人牙髓细胞中的VEGFA mRNA、VEGFB mRNA、VEGFC mRNA表达要高［12］。

上皮组织与外胚间叶组织的互相作用贯穿于牙胚发生发育到牙体组织形成的整个过程，内外釉上皮细胞与牙乳头细胞分泌的细胞因子互相作用，促进成釉细胞与成牙本质细胞的分化成熟。VEGFA在上皮-外胚间质相互作用的细胞之间，作为信号转导因子发挥重要的作用［13］。在人的乳牙胚成釉细胞、星网状层细胞、成牙本质细胞以及基底侧的成牙本质细胞突之中存在着VEGFA和VEGFR2蛋白，Miwa等［14］推测VEGF从血管被分泌到牙乳头上皮-外胚间叶组织交界（基膜）的细胞基质中，主要以VEGF-纤连蛋白复合物的形式储存于基膜的细胞外基质，通过基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）剪接，被释放的VEGF作用于釉质上皮细胞、成釉细胞和成牙本质细胞表面的VEGFR2，进而影响釉质与牙本质的形成。

在釉质和牙本质基质的形成过程中，成釉细胞和成牙本质细胞不仅受牙胚中生长因子的调节，还受到全身激素，如生长激素和褪黑激素的作用［15］。在钟状期的牙乳头上1/3部分，成釉细胞和成牙本质细胞附近存在着较多的CD31和CD34阳性血管内皮细胞［16］。这些发现强烈表明，成釉细胞、成牙本质细胞和牙乳头细胞分泌的VEGFA可在牙体组织形成阶段诱导血管生成，以便获得更多养分和接收来自外周血的信号分子。

有学者在对大鼠的研究中发现，VEGF表达于大鼠牙囊细胞，其表达水平与大鼠牙胚萌出过程中破骨细胞形成的二次高峰期密切相关，即VEGF可能是参与牙萌出调控的重要的细胞因子。也有学者发现，VEGF mRNA可表达于体外培养的人牙囊细胞，牙囊细胞内有VEGF蛋白的表达。他们在牙囊细胞培养上清液中也检测到了VEGF蛋白。这些证据表明，体外培养的人牙囊细胞可合成和分泌VEGF，考虑到上述VEGF在骨改建中的作用，提示VEGF在人牙萌出过程中可能发挥重要的作用。Janebodin等［17］经过一系列的研究后发现，牙髓干细胞具有血管内皮周细胞的特性，可诱导血管形成。此外，牙髓干细胞诱导血管生成的能力具有VEGFR2依赖性，牙髓干细胞通过分泌VEGF配体与血管周细胞相关联，增强血管生成。

3　VEGF与牙发生相关的信号转导通路

许多与胚胎发生相关的基因在牙胚中央的釉结中都有表达，这些基因涉及的信号转导通路也参与牙的发生，例如转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1～3，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）2、4、6、7，成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）4，无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族（wingless-type mice mammary tumour virus integration site family，WNT）/β-连环蛋白信号转导通路等。杨海兵等［18］构建重组质粒pcDNA3.1 hisA-VEGF165，经酶切及测序验证正确后，将其和pcDNA3.1 hisATGFβ1转染人根尖乳头细胞，采用实时定量荧光聚合酶链反应检测转染效率和骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP）1的表达。结果显示，VEGF165和TGFβ1可促进人根尖乳头细胞DSPP和OCN mRNA的表达，抑制DMP1 mRNA的表达，对BSP mRNA的表达没有明显影响，而且VEGF165和TGFβ1间并未无明显的协同作用。他们分析后推测，这可能与VEGF165和TGFβ1的转染效率有关，过高或过低的转染率均不利于以上因子的表达，两者间的协同作用可能在VEGF165和TGFβ1适量表达时才存在。

BMP2、4通过刺激同源盒转录因子来调节牙的发生发育。VEGF可以通过诱导牙髓成纤维细胞产生的碱性成纤维细胞生长因子来刺激牙髓细胞增殖。在胚胎大鼠颅骨破骨细胞的原代培养中，BMP2可将破骨细胞中的Vegf mRNA表达提高，而且两者之间存在着时限和剂量依赖性关系。

在FGF的信号转导通路中，FGF与细胞膜表面的酪氨酸激酶型受体FGFR结合并发生二聚化，从而激活酪氨酸激酶，在激活含SH2结构的蛋白质/ Frs-Raf/促丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶-促丝裂原激活蛋白激酶激酶-促丝裂原激活蛋白激酶信号转导通路的基础上，通过大量释放PKC、磷脂酶C、磷脂酰肌醇-3-激酶系统和Ca2+，向细胞内转导信号。PKC是VEGF mRNA的上游调控子，由此可以认为FGF可间接地促进VEGF的表达。

WNT/β-连环蛋白信号转导通路是牙发生过程中诱导釉结形成、上皮间质相互作用的信号转导通路之一［19］。当WNT信号激活后，β-连环蛋白的磷酸化受影响。非磷酸化的β-连环蛋白不能被蛋白酶体降解，从而导致β-连环蛋白在细胞质内积聚并移向核内；当游离的β-连环蛋白进入细胞核内，即与T细胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴细胞样增强因子结合，激活TCF转录活性，调节靶基因的表达。在VEGF基因启动子上游805 bp位点有TCF4结合元件，VEGF基因表达受到WNT/β-连环蛋白信号转导通路的调控。有学者［20］利用siRNA靶向沉默β-连环蛋白以阻断WNT/β-连环蛋白信号转导，明显地抑制了子宫内膜异位症裸鼠模型异位子宫内膜中VEGF和MMP9的表达。

［1］Ferrara N，Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial cells. 1989［J］. Biochem Biophys Res Commun，2012，425（3）：540-547.

［2］Ferrara N，Gerber HP，LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors［J］. Nat Med，2003，9（6）：669-676.

［3］Liu Y，Berendsen AD，Jia S，et al. Intracellular VEGF regulates the balance between osteoblast and adipocyte differentiation［J］. J Clin Invest，2012，122（9）：3101-3113.

［4］Liu Y，Olsen BR. Distinct VEGF functions during bone development and homeostasis［J］. Arch Immunol Ther Exp（Warsz），2014，62（5）：363-368.

［5］Costa N，Paramanathan S，Mac Donald D，et al. Factors regulating circulating vascular endothelial growth factor（VEGF）： association with bone mineral density（BMD） in post-menopausal osteoporosis［J］. Cytokine，2009，46（3）：376-381.

［6］Roland CL，Dineen SP，Lynn KD，et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor reduces angiogenesis and modulates immune cell infiltration of orthotopic breast cancer xenografts［J］. Mol Cancer Ther，2009，8（7）：1761-1771.

［7］Choi JS，Shin YJ，Lee JY，et al. Expression of vascular endothelial growth factor receptor-3 mRNA in the rat developing forebrain and retina［J］. J Comp Neurol，2010，518（7）：1064-1081.

［8］Feng Y，Wang W，Hu J，et al. Expression of VEGFC and VEGF-D as significant markers for assessment of lymphangiogenesis and lymph node metastasis in non-small cell lung cancer［J］. Anat Rec，2010，293 （5）：802-812.

［9］蔡源源. 血管内皮生长因子的调控及其作用研究进展［J］. 组织工程与重建外科杂志，2011，7（1）：51-54. Cai YY. Advances in the regulation and role of vegf ［J］. J Tissue Eng Reconst Surg，2011，7（1）：51-54.

［10］Aida M，Irié T，Aida T，et al. Expression of protein kinases C betaI，betaⅡ，and VEGF during the differentiation of enamel epithelium in tooth development［J］. J Dent Res，2005，84（3）：234-239.

［11］Takahashi S，Ambe K，Kon H，et al. Immunohistochemical investigation of lymphatic vessel formation control in mouse tooth development： lymphatic vessel-forming factors and receptors in tooth development in mice［J］. Tissue Cell，2012，44（3）：170-181.

［12］Chen S，Santos L，Wu Y，et al. Altered gene expression in human cleidocranial dysplasia dental pulp cells［J］. Arch Oral Biol，2005，50（2）：227-236.

［13］Lumsden AG. Spatial organization of the epithelium and the role of neural crest cells in the initiation of the mammalian tooth germ［J］. Development，1988，103（Suppl）：155-169.

［14］Miwa Y，Fujita T，Sunohara M，et al. Immunocytochemical localization of vascular endothelial growth factor and vascular endothelial growth factor receptor-2 of the human deciduous molar tooth germ development in the human fetus［J］. Ann Anat，2008，190 （3）：246-251.

［15］Kumasaka S，Shimozuma M，Kawamoto T，et al. Possible involvement of melatonin in tooth development： expression of melatonin 1a receptor in human and mouse tooth germs［J］. Histochem Cell Biol，2010，133（5）：577-584.

［16］Ide S，Tokuyama R，Davaadorj P，et al. Leptin and vascular endothelial growth factor regulate angiogenesis in tooth germs［J］. Histochem Cell Biol，2011，135（3）：281-292.

［17］Janebodin K，Zeng Y，Buranaphatthana W，et al. VEGFR2-dependent angiogenic capacity of pericytelike dental pulp stem cells［J］. J Dent Res，2013，92（6）：524-531.

［18］杨海兵，韩萱，杨琳，等. 血管内皮生长因子和转化生长因子β1基因调控人根尖乳头细胞矿化相关因子的研究［J］. 华西口腔医学杂志，2012，30（5）：468-473. Yang HB，Han X，Yang L，et al. Study of vascular endo-thelial growth factor and transforming growth factor β1 genes regulate the mineral-related genes in human cells from apical papilla［J］. West China J Stomatol，2012，30（5）：468-473.

［19］刘帆，刘奕. 牙齿发育相关信号通路研究进展［J］.中国实用口腔科杂志，2013，6（8）：503-506. Liu F，Liu Y. Research progress of the related signal pathway of tooth development［J］. Chin J Pract Stomatol，2013，6（8）：503-506.

［20］郑婷婷，刘义，于岚，等. 靶向siRNA阻断Wnt/ β-catenin信号通路对子宫内膜异位症裸鼠模型异位子宫内膜VEGF和MMP-9表达的影响［J］. 华中科技大学学报（医学版），2011，40（1）：22-27. Zheng TT，Liu Y，Yu L，et al. Gene silencing of wnt/ β-catenin signaling pathway by sirna interference inhibits the expression of vegf and mmp-9 in ectopic endometrium of nude mouse endometriosis model［J］. Acta Med Univ Sci Technol Huazhong（Med Sci Edit），2011，40（1）：22-27.

（本文采编王晴）

Relationship between vascular endothelial growth factor and tooth occurrence development

Hou Liwen，Jiao Ting，Xie Ming. （Dept. of Oral Prosthodontics，The Ninth People's Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiao Tong University；Shanghai Key Laboratory of Stomatology，Shanghai 200011，China）

Q 51

A

10.7518/gjkq.2016.05.024

2015-12-12；［修回日期］2016-06-03

侯丽雯，学士，Email：wendy_0606@163.com

焦婷，副主任医师，博士，Email：jiao_ting@126.com