牙切片器官培养模型的建立与应用

刘斐　贺京军

广东省第二人民医院VIP体检中心　广州 510220

·综述·

牙切片器官培养模型的建立与应用

刘斐贺京军

广东省第二人民医院VIP体检中心广州 510220

牙切片器官培养模式是一种有效的在体外保持了牙本质牙髓复合体生物学特性的实验方法，可用于进行各种生物性，物理性，化学性组织损伤和修复的研究。本文就牙切片器官培养模型的建立方法和实验应用进展作一综述。

牙切片；器官培养；模型

This study was supported by Natural Science Foundation of China（81371137） and Youth Science and Technology Personnel Cultivation Project of Scientific Research Initiative in Southern Medical University（PY2014N051）

［Abstract］The tooth slice organ culture model provides a valuable approach for the in vitro study of biological and physical chemical injury and repair processes in the dentin pulp complex over long periods. This paper introduces recent studies on the establishment and application of the model.

［Key words］tooth slice；organ culture；model

牙髓病是一种常见的口腔疾病，直接危害口腔健康，也是引起疼痛的主要原因。牙髓病临床表现复杂，要进一步探讨其发病机制及治疗评价，单凭临床观察远远不够，需要建立稳定、可靠的实验模型。牙切片器官培养的方法在实验中能有效地保留牙髓牙本质复合体，相较于传统的细胞培养更能真实地模拟临床中牙髓组织对各种外来刺激的生物学反应，进而逐渐被学者们应用于实验研究当中。本文将对牙切片模型的建立方法和检测，以及该类模型在牙髓生物学中的研究应用进行综述。

1　模型的建立

1996年Magloire等［1］牙切片至厚度约为750 μm后完全浸没于培养液体中，成功体外培养约30 d。Sloan等［2］在此基础上改良为厚牙片联合应用Trowell器官培养法。将Wistar大鼠中切牙在蒸馏水冷却下，用金刚钻慢速切割机横向切割约2.0 mm厚牙片，用含1%低熔点琼脂培养液包被，冷却后将被半固体培养基包被的牙切片放置于Trowell的乙酸纤维滤膜上，进行气液面双向培养。朱晓茹等［3］采用Sloan的牙切片方法将成年人健康前磨牙处理为厚度2.0 mm后在体外培养，并有效地保持其生物特性约1周。相较于完全浸入培养法，琼脂半固定培养法加大了实验的调控性，可以进行定位施药技术，实验结果更为真实准确。

2　模型的检测

在形态学方面，通过苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）色观察在各个培养期牙髓牙本质复合体的形态结构变化。如各细胞层的结构形态；成牙本质细胞与牙本质连接紧密程度；单位面积内细胞的密度。电镜观察培养期中细胞内和细胞间的超微结构变化。如牙本质小管中的成牙本质细胞突起的形态结构；与临近成牙本质细胞间的连接紧密度；在培养后期可能出现的细胞长度缩短，胞内的空泡性变，胞间的连接减少或消失。判断体外培养的牙髓牙本质复合体形态的完整性［2-4］。

在生物特性方面，用免疫组化的方法检测，牙切片体外或体内培养各期中前期牙本质和成牙本质细胞中牙本质涎磷蛋白（dentin sialophospho protein，DSPP）表达变化情况，DSPP是与成牙本质细胞的分化密切相关的特异性表达蛋白，是检测成牙本质细胞活性的生化指标。观察牙切片培养过程中是否保持了正常牙髓组织的生物性能［3-4］。

3　实验模型的在牙髓生物学中的应用

3.1生物性刺激

牙髓细胞离体培养是研究外源性生物因子对牙髓组织刺激的最常用的方法，有学者［5-6］为了在体外培养时更好地保持细胞的生物学特征，采用了不同材料的支架混合细胞进行三维立体培养。Magloire最早将牙切片至厚度约750 μm，放置于培养皿中，并完全浸没于培养液体中，在体外培养约30 d。Sloan等［2，7］在此基础上采用厚牙片联合应用Trowel 器官培养法，将Wistar大鼠中切牙在蒸馏水冷却下，用金刚钻慢速切割机横向切割约2.0 mm厚牙片，用含1%低熔点琼脂培养液包被，冷却后将被半固体培养基包被的牙切片放置于Trowel的乙酸纤维滤膜上，进行气液面双向培养；然后使用形态学方法观察到牙片各层组织细胞能维持正常生物形态2周左右。他们通过在半固定培养基上放置含有外源性因子转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1、2、3，骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-7琼脂糖微球于牙片上的成牙本质细胞区，观察其作用因子能否促进成牙本质细胞分泌细胞外基质，影响前期牙本质形成，与作用浓度是否呈相关性。Gonçalves等［8］在研究血管内皮生长因子对（vascular endothelial growth factor，VEGF）人牙髓组织的再生作用时，将48颗健康完整第三磨牙在磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）冷却下用锯式切片机横向切割成厚度为1.5 mm的牙片，实验组加入定量的VEGF刺激培养后将牙切片植入裸鼠体内，7 d后行形态学观察发现，牙切片在体内培养后仍能保持组织的正常形态结构。

牙切片组织培养法同样适用于检测口腔材料的生物相容性。Moseley等［9］在研究氟化物对细胞外基质矿化作用的影响时，在PBS冷却下将Wistar大鼠的中切牙用锯式切片机横向切割为厚度2.0～3.0 mm的牙片，置于Trowell上培养，在半固定培养基混入一定浓度的氟化物，培养至1～14 d时行形态学观察，并计算成牙本质细胞层和牙髓中心区域内完整细胞的密度，分析胞质胞核大小比例以及新形成的前期牙本质的宽度，并通过3H-脯氨酸法测定相关胶原合成情况。Murray等［10］为研究不同的盖髓材料与牙髓组织间的生物相容性，将新鲜离体的Wistar大鼠中切牙备洞，去除玷污层，将盖髓材料新鲜调制后充填，表面涂布一层牙蜡防止材料的溶解，蒸馏水冷却下慢速横向切割为厚度2 mm的牙片，置于Trowell上培养，培养至10 d时行形态学观察单位面积内的成牙本质细胞层、成牙本质细胞层下方以及牙髓成纤维细胞层3处的细胞状态、数目和细胞间的连接情况。Saw等［11］采用同样的培养方法，并使刺激药物直接或间接接触牙片，培养48 h后行形态学观察，检测接触区域的细胞形态、细胞间连接情况，计算单位面积内完整细胞的密度；噻唑兰（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium，MTT）法检测组织块内细胞增值的数目，同时比较常规的标准株L929的体外培养模式。

张丹等［12］为研究不同盖髓剂对牙髓的修复作用，将健康完整的30颗前磨牙备洞后露髓后随机分组，用自酸蚀黏结剂和氢氧化钙盖髓，复合树脂充填窝洞，冷却下用锯式切片机纵向切割为厚度2.0 mm的牙片；普通培养14 d后行HE检测，免疫组化监测DSPP和氢氧化钙的染色情况。朱晓茹等［13］为研究尼莫地平对人牙本质的形成和矿化作用的影响，采用健康完整的成年磨牙，用慢速切片机横向切割为厚度2.0 mm的牙片，置于Trowel上培养。相较于用标准株L929细胞系来与生物材料共培养的方法，牙切片培养法充分综合利用了其形态学和生物性的优势，能更加有效地真实模拟临床效果，实验结果更为准确。

3.2物理性刺激

牙切片的模型同样适用于物理因素的干扰实验，在保留了牙髓牙本质复合体的模型上更能真实有效地反映牙髓情况。Seux等［14］为了研究脉冲Nd：YAG激光照射对牙本质牙髓复合体的反应，将36颗健康完整的第三磨牙统一备洞后用不同频率和能量值的脉冲Nd：YAG激光照射。随后在PBS冷却下用锯式切片机将组织切割为厚度约0.75 mm的牙片，普通培养至4 d时，行形态学观察实验各组的细胞形态改变以及不同的照射频率和能量值的影响下，洞底区细胞裂解的程度和范围和微脓肿的形成频率的变化过程，并通过免疫组化的方法检测洞底下方及髓核处Ⅳ和Ⅲ型胶原的表达变化以及伴随新生血管的形成过程。Brucoli等［15］在Seux等［14］的基础上对牙切片进行X线摄影像行光密度值分析，观察受辐照区域的牙片细胞的密度值改变，进一步证明经脉冲Nd：YAG激光能促进组织的矿化程度并加强牙髓组织的防御修复机制。

Al-Daghreer等［16-17］为检测治疗性低强度脉冲超声（low intensity pulsed ultrasound，LIPUS）对牙髓的长期和短期的修复作用，分别将92和63颗健康完整的前磨牙在PBS冲洗下用慢速切片机横向切割厚度为0.6 mm的牙切片，随机分组后LIPUS照射处理。普通培养1、5 d后行形态学观察完整成牙本质细胞密度和前期牙本质的厚度，并通过逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription poly-merase chain reaction，RT-PCR）检测人牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP）1、DSPP、骨保护蛋白（osteoprote-gerin，OPG）等先关指标的变化情况。

李昊妍等［18］为研究牙体热损伤后牙本质牙髓组织中基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2和9的表达变化，将30颗健康完整的第三磨牙在面统一制备直径2.0 mm、深度为牙本质厚度的1/2的窝洞，PBS冷却下500 HC金刚砂磨片纵向切割为厚度2.0 mm的牙片，普通培养14 d后，行免疫组化染色、实时PCR和蛋白质印迹法，检测模型组MMP-2、MMP-9在成牙本质细胞和牙髓细胞中表达情况。Murray等［19］为研究不同的备洞和处理条件下对牙髓的影响，在Wistar大鼠中切牙上直接进行备洞处理后直接拔出并切片，置于Trowel培养2周，通过形态学方法观察牙本质牙髓复合体的反应情况，分析不同的刺激因素及修复因素对牙髓组织的影响。

4　展望

牙切片体外培养模式有效保留了釉质、牙本质以及牙本质牙髓复合体的器官完整性，更好地体现了原有的细胞与细胞、细胞与基质、细胞与牙齿硬组织的三维关系［20］。在形态和功能上，均能更为真实地模拟体内环境，为牙体组织损伤修复的研究、细胞与基质间相互作用的研究以及修复性牙本质形成的研究提供了一个实验模型。而且能在同一实验对象中设立参照组，减少因个体差异性所产生的误差［12-13］。以人类的牙髓组织为研究对象，避免了研究对象的种属差异性，使实验结果更具有临床意义。

通常在器官培养的过程中都存在有培养液的有效成分不能充分渗入到组织块中，造成实验培养周期不长的问题。牙体组织在薄切片的过程中不可避免地会存在机械性损伤和软硬组织分离的情况，组织片越薄，损伤越明显。此外，由于牙体组织的硬度值较高，慢速切割机和切割条件的同样限制了此类实验方法的应用和开展。Téclès等［21］和张金艳等［22］分别建立了人和大鼠全牙器官的体外培养模式，有效避免了在切片过程中对组织形成的机械性损伤，但与培养环境接触有限，仅能在体外保持正常组织形态约1周。现有的牙切片培养模式大都采用的是牙切片联合应用Trowel器官培养方法，而Trowel器官培养方法中琼脂以及乙酸纤维滤膜的平展性均有可能对组织细胞的生长产生影响。牙切片厚度值多少为最佳，才能够最大程度地延长体外培养时间，并将切片过程中对实验模型本身造成的机械性损伤降到最低，仍是需要进一步研究的问题。

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（本文编辑张玉楠）

Advances in establishment and application of tooth slice organ culture model

Liu Fei，He Jingjun.（VIP Medical Center，The Second People's Hospital of Guangdong Province，Guangzhou 510220，China）

R 322.4+1

A

10.7518/gjkq.2016.05.010

2016-01-22；［修回日期］2016-05-09

国家自然科学基金（81371137）；南方医科大学科研启动计划青年科技人员培育项目（PY2014N051）

刘斐，主治医师，硕士，Email：kqliufei@126.com

贺京军，副主任医师，学士，Email：hjjs2@126.com