基因分型技术在院内感染铜绿假单胞菌中的应用研究进展*

张 伟，徐益恒 综述，邰文琳 校审

(昆明医科大学第二附属医院检验科,昆明 650101)



·综 述·

基因分型技术在院内感染铜绿假单胞菌中的应用研究进展*

张 伟，徐益恒 综述，邰文琳△校审

(昆明医科大学第二附属医院检验科,昆明 650101)

铜绿假单胞菌； 基因分型； 院内感染

铜绿假单胞菌是世界范围内医院获得性感染的重要病原菌。对引起疾病的病原菌基因分型的传染源确定、阻止病原菌的传播、潜在病原菌危险的控制和医院耐药监测有很重要的作用。细菌分型作为分子流行病学研究调查的主要研究内容,其结果的准确性依赖于分型方法是否稳定可靠、准确[1]。细菌分型的方法包括依靠生理、生化特征的表型分型法和近年来流行使用的基因分型法。表型分型方法是根据细菌的生理、生化等表型特征进行分类包括噬菌体分型法、血清型法、营养分型法和药物敏感试验等，这些分型的方法由于受到细菌本身复杂因素及方法的敏感性因素影响，往往就无法有效对不同的菌株进行区分，因此其应用受到很大限制。运用分子生物学方法检测细菌基因型来鉴别菌株的基因分型法，是1980年起逐渐被引入微生物鉴定领域，成为目前较主流的流行病学研究工具，在基因组水平对细菌进行鉴定与分类，与表型分型相比更加细化，对院内引起感染的铜绿假单胞菌近亲缘性，即克隆性菌株鉴定有重要意义，从根本上确定菌株遗传基础的相互联系和变异，为流行病调查工作中确定菌株间的遗传亲缘关系等方面提供更为有力的实验室证据[2]。基因分型法目前运用较多的有：重复序列聚合酶链反应(PCR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、多位点可变数目串联重复序列分析(VNTR)、限制性片段长度多态性PCR(RFLP)、多位点序列分型(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)。分型方法是在微生物学、遗传学、流行病学等交叉学科一系列研究中的工具，选择合适的方法，有效监测院内病原菌的分子流行病学变化，如此研究预期和最终目的才能达到。现就目前常用于铜绿假单胞菌基因分型的技术进行简要介绍。

1 重复序列PCR

重复序列PCR是采用特定引物对细菌基因组重复序列的DNA进行扩增，高度保守的重复序列之间的不同区域可表现不同的图谱，然后经凝胶电泳分析其多态性。目前，运用最多的是肠杆菌基因间重复共有序列(ERIC)PCR，应用于细菌分类和菌种鉴别。ERIC是最常用的一类引物，长度为126 bp，位于染色体非编码转录区，ERIC-PCR分辨效果好，可重复性好，特别适用于基因型的辨别。PFGE目前被认为是细菌基因分型技术的“金标准”[3]。孙晶等[4]在对铜绿假单胞菌ERIC-PCR和PFGE方法学比较分析发现，两种方法的符合率近90%，在ERIC-PCR方法重复5次的结果相似度高于75%；Han等[5]报道对铜绿假单胞菌研究中发现，在同一血清型中采用ERIC-PCR分出多个不同型别铜绿假单胞菌，采用ERIC-PCR分辨能力和重复性与PFGE很相近，均较血清分型方法较好，但ERIC-PCR用时短，操作简单，成本低，值得在流行分子病学研究中推广。在院内感染耐药监测研究中，张勇等[6]对75株耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌ERIC-PCR同源性分析，结果显示分型为8种，但以A、B型为主，分别占34.7%和22.7%，表明耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌在院内以克隆株传播，ERIC-PCR是铜绿假单胞菌同源性分析有效工具，以其多种优点在耐药监测和预防等方面有明显的优势[7]。尽管ERIC-PCR有很多优势，但在近缘菌株分析中分辨力还有待加强，且此方法对软件的要求和数据分析能力较高，普通实验室还难普及[8]。

2 RAPD

RAPD是20世纪90年代末发展起来的一种新方法，该法使得对非血清型菌株从基因多态性的水平进行分型的鉴定成为可能[9-10]。以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基对)为引物，在热稳定的DNA 聚合酶(Taq酶)作用下，进行PCR扩增。这种方法可对物种基因背景不清楚的情况下对基因组DNA水平进行研究[11]。目前研究铜绿假单胞菌的特点主要在遗传学分型、抗生素表型和血清学分型，主要是评价多种分离株关系的分型能力[12]。近来出现的RAPD-PCR方法对铜绿假单胞菌的多种细菌分型则成为可靠的手段，与传统的对细菌鉴定分型方法比较，具有简便、快速、灵敏度高，不需要已知基因组序列的优势[11-12]。RAPD技术是在基因水平上对菌株间差异进行研究，最终可以表现出克隆间的差别和种系发育中的相互关系[13]。相异指数是RAPD技术中重要的指标，是指对2个分离株进行比较，相异指数越小，相似性越大。在聂道海等[14]报道中，采用Phylip和TREEview等软件对RAPD指纹图谱相异指数分析。患者不同时间的分离株相异指数最小为零，说明有可能克隆菌株。最大为89.47%，说明两次感染来源不同。同一克隆株于空间上分布集中的趋势,提示可能存在通过某一未识别的共同传播源传播同一病区来自不同患者的铜绿假单胞菌显示相同的RAPD 型别,提供了医院感染局部流行的证据。RAPD分型和耐药谱分型比较研究中，RAPD分型谱相同，其耐药谱也大致一样，耐药谱分型一致的，其RAPD分型可不同，说明RAPD分型谱和药谱分型遗传关系有一定的差异。所以，耐药谱分型可作为RAPD分型进一步补充分型。虽然RAPD技术简便、对试验条件要求低的广泛使用，但研究人员也慢慢意识该技术存在试验条件影响大、可重复性低等一系列问题。国内外仍有很多实验采用该方法对菌株进行流行病学研究和分型判断[12]。

3 VNTR

VNTR是在原核和真核生物基因中一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，以首尾相连的方式串联一起，拷贝数在10～1 000的PCR技术[15]。多态性指数(DI)是VNTR分型能力的一个指标，DI值低，说明分型能力不好，特别是对近缘性菌株区分能力不足，DI值高，可导致非同源性相似。DI值在0.48～0.89，即可避免非同源性相似性，又有分型能力。近年来已有国内外关于VNTR对铜绿假单胞菌基因分型的报道[16]。李艳君等[17]在铜绿假单胞菌院内感染溯源性研究中采用VNTR方法，建立DI分布适中的12个VNTR新筛选位点方法，对98株铜绿假单胞菌进行分型，共分类为5群，88个基因型，认为同病房分离菌株有一定同源性。MLVA是基于VNTR方法发展起来的新技术。近来有研究以铜绿假单胞菌的全基因组序列为参考的多个VNTR 位点的MLVA 方法[18]。随后有人在这基础上建立15个VNTR位点的MLVA方法使分型更简单、便捷，是目前MLVA对铜绿假单胞菌基因分型的主要研究方法[19]。不同的铜绿假单胞菌VNTR位点的数目数字化后，在数据库中比对，菌株的差异就能用数字表达[20]。尽管采用数量不同的位点，都能进行分型，且随着技术的进步分型能力越来好，但缺点是数量有限，而且在基因组上分布不均匀，这就极大限制其在基因定位中的应用，VNTR也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的不足。

4 RFLP

RFLP是指用不同的限制性内切酶对DNA分子处理后，通过琼脂糖凝胶电泳对DNA片段进行分析。国外报道，RFLP也可以筛选出铜绿假单胞菌的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)基因，在流行病学基因研究、检测新的变异有重要意义[21]。RFLP己被用于构建基因组遗传图谱、基因定位、生物进化和分类的研究。由于只对单拷贝基因组序列进行鉴定，且需要多种内切酶及探针，操作步骤繁琐，但RFLP较之RAPD的优势是突变类型可以确定是由碱基突变或倒位、还是由插入缺失造成的。在RFLP技术基础上发展起来的扩增片段长度多态性分析(AFLP)是一种新的标记技术，是先采用限制性内切酶对基因组DNA进行切割，然后再将切割后的双链接到DNA的末端，使邻近的限制性内切酶位点和短的接头序列作为结合位点。它拥有了RFLP的高效性和可靠性，但目前这一技术使用还不广泛。

5 MLST

MLST方法近年来成为流行的基因分型方法，通过采取测定菌株多个管家基因的DNA序列进行分型，管家基因几乎不会发生遗传漂变而存在于所有菌株中，所以采用管家基因进行MLST分型[22]。测定7个管家基因(acsA、aroE、guaA、mutL、nuoD、ppsA 和trpE)500 bp左右DNA序列片段代表基因组的分子多样性，每个管家基因的等位基因由发现和递呈的时间顺序分配，每类菌株所有的等位基因号按照规定顺序排列成为等位基因谱，也叫序列型(ST)[23]。此种方法不需要培养病原菌，可直接从标本中进行扩增，获得等位基因图谱，有群体遗传学分析的功能，且能够准确提供菌种评估的信息，比传统的免疫学方法更可靠和准确，自从Gomila等[24]运用此方法分析铜绿假单胞菌的遗传多样性，现MLST数据库已建立且不断完善，结果的可比性高，适合国际实验室间的数据进行比较，可以对局部感染爆发的评估和菌群结果的评价。目前运用MLST分型对铜绿假单胞菌的研究越来越多。研究称铜绿假单胞菌的遗传背景是多样性的。国外报道铜绿假单胞菌以ST235型最为常见，但也伴其他ST型[25]。铜绿假单胞菌容易引起暴发流行，在西班牙2007～2008年暴发两起感染，是ST235所致[26]。韩国也有此型的多重耐药菌株传播。虽然MLST与PFGE和MLVA比较分辨力一般，但其结果可在全世界进行比较，发现传播现象和分子流行病学研究，受到研究者的青睐。

6 PFGE

PFGE是采用限制性内切酶(SpeⅠ酶)将DNA识别并内切成若干片段，再脉冲场凝胶电泳，电场不断在两种方向(有一定夹角，而不是相反的两个方向)变动，来分离大小从10 kb至10 Mb的DNA分子。因其分辨率高，重复性好被公认为铜绿假单胞菌基因分型的金标准[27]。其结果可作为控制医院感染的重要基础。能帮助临床工作者发现潜在的危险因素，进而及时切断流行菌株的来源和传播途径。对不同患者分离的同一病原菌进行亲缘性分析，是判断医院是否存在散在性感染和暴发流行性感染的有效工具。自1984年报道了脉冲场电泳的方法以来，目前已得到全面发展，各种条件得到优化，PulseNet细菌分子分型网络提供技术下载，且Tenover等研究了结果的解释标准，统一技术对结果解释的影响，利于PFGE技术的运用，但是操作相对耗费时间和精力且检测通量小，导致其不能对大量菌株进行研究，是其应用的不足。

7 小 结

铜绿假单胞菌在院内感染由于滥用抗菌药物从而导致的变异，容易引起院内的暴发流行，表型分型的不足采用基因分型方法弥补，但基因分型方法也存在不足，特别是不能解决院内铜绿假单胞菌感染暴发流行的实时在线分析能力，也没有统一的标准来对分型方法进行指导，导致各种方法均有优缺点。理想的分型方法有以下特征：对不同患者同一菌株的分型能力强且操作简便、费用低；对同一患者不同时期同一菌株高分辨能力，即将同一克隆或遗传相近的菌株分辨出来；最重要的一点是具有良好的复现性。但目前的技术还不能做到。

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云南省卫生科技计划项目(2014NS114)；昆明医科大学研究生创新基金项目(2015S31)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.032

A

1673-4130(2016)23-3322-04

2016-05-28

2016-08-18)

△通讯作者，E-mail:taiwenlinlin@sohu.com。