乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药株(RT A181T)感染性克隆的构建及在Huh7细胞中的表达*

赵建华,陆仁飞

(江苏省南通市第三人民医院检验科 226006)



·论 著·

乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药株(RT A181T)感染性克隆的构建及在Huh7细胞中的表达*

赵建华,陆仁飞△

(江苏省南通市第三人民医院检验科 226006)

目的 利用重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)快速构建乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦酯耐药株(RT A181T)感染性克隆，观察重组质粒在Huh7细胞中的表达，建立HBV阿德福韦酯耐药株(RT A181T)的体外研究细胞模型。方法 设计保守引物，从慢性乙型肝炎阿德福韦酯耐药患者血清中扩增全长HBV基因组，利用SOE-PCR技术构建1.3倍基因组长度的感染性克隆质粒pHBV1.3，转染肝癌细胞系Huh7，采Western Blot、Real-time PCR检测感染性克隆复制以及表达情况，同时用抗病毒药物拉米夫定以及阿德福韦酯验证对感染性克隆复制及表达的抑制情况。结果 成功构建了HBV阿德福韦酯耐药株感染性克隆质粒pHBV1.3(RT A181T),该质粒在Huh7细胞系中能有效复制、转录和表达。拉米夫定能有效抑制该感染性克隆的复制和表达，阿德福韦酯不能抑制该感染性克隆的复制和表达。结论 构建的HBV阿德福韦酯耐药株感染性克隆质粒pHBV1.3(RT A181T)在体外能高效复制及表达蛋白，其转染细胞可用于HBV复制机制及抗病毒研究。

乙型肝炎病毒； 阿德福韦酯； 耐药； 感染性克隆

乙型肝炎病毒(HBV)感染在全世界广泛流行，据文献报道全球约有20亿人感染过HBV，每年大约有100万人死于因HBV感染而继发的慢性乙型肝炎、肝硬化和原发性肝癌，严重影响了人类的健康[1-3]。开展HBV研究的困难之一就是缺乏很好的体内感染动物模型及体外感染细胞模型。目前，体外感染的细胞模型主要以稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞系为主[4]。该HBV的病毒基因型为D型、血清型为ayw的野生型[5]。近年来，拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦及替比夫定等核苷(类)抗病毒药物已经广泛应用于慢性乙型肝炎的临床治疗。随着大范围、长时间的抗病毒药物治疗，HBV耐药问题已经成为临床慢性乙型肝炎治疗的棘手问题[6]。相应的，构建各种耐药株的感染性克隆用于HBV复制机制以及抗病毒研究已显得十分迫切与必要。大量研究证实，HBV的1.1、1.2、1.3倍体重组质粒均能在人类的肝癌细胞系中完成核酸的复制及相关蛋白的表达，其中1.3倍体HBV核酸复制水平和蛋白表达水平是最高的[7-8]。本研究从慢性乙型肝炎阿德福韦酯耐药患者血清中扩增全长HBV基因组，利用重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)技术快速构建1.3倍HBV的感染性克隆质粒pHBV1.3(RT A181T)，在体外验证了该感染性克隆的核酸复制、蛋白表达以及抗病毒药物耐药情况。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人肝癌细胞株Huh7用含10%胎牛血清(Gibco公司)、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基、37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。细胞株购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

1.2 方法

1.2.1 HBV阿德福韦酯耐药株基因组DNA的提取 HBV血清标本均来源于南通大学附属第三医院检验科，患者均长期服用阿德福韦酯，并出现病毒学突破被诊断为阿德福韦酯临床耐药，标本中HBV的DNA载量在104～107copy/mL。磁分离试剂盒(北京鑫诺美迪公司)抽提HBV DNA，提取方法严格参照说明书，提取的HBV DNA在-20 ℃保存备用。

1.2.2 HBV全长基因组的克隆 参考文献[9]的引物设计，F1:5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA-3′；R1:5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G-3′。以上述方法提取的HBV DNA为模板,采用高保真性聚合酶KOD plus(Toyobo公司)进行PCR扩增，DNA胶回收试剂盒(上海生工生物有限公司)琼脂糖凝胶电泳胶回收PCR产物，用平末端克隆载体试剂盒pEASY-Blunt Zero cloning kit(北京全式金公司)连接目的片段和载体，然后转化感受态细胞TOP10(Tiangen公司)，涂板过夜培养，挑取单菌落，酶切鉴定，阳性菌落送上海迈浦生物公司测序。测序结果采用MEGA5软件BLAST分析。

1.2.3 利用SOE-PCR构建1.3倍体HBV 利用SOE-PCR技术构建HBV的感染性克隆-1.3倍体HBV(阿德福韦酯耐药，RT A181T)，命名为pHBV1.3(RT A181T)，测序验证。

1.2.4 感染性克隆Huh7细胞的转染及表达 感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)脂质体转染肝癌细胞系Huh7，转染方法参照说明书。共转染3种质粒，实验组为质粒pHBV1.3(RT A181T)，转染空载体pBluescript KS(+)(阴性对照)和pHBV1.3(C)质粒(阳性对照)。转染后6 h换液，48 h后分别吸取培养上清液和收集细胞，通过免疫印迹实验检测蛋白表达水平，Real-time PCR检测复制水平。

1.2.5 免疫印迹试验 裂解转染后的Huh7细胞,上样，SDS-PAGE电泳，电泳结束后转膜，转膜后5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜。一抗使用浓度如下：鼠抗-HBs单克隆抗体1∶1 000稀释，兔抗-HBc单克隆抗体1∶4 000稀释，兔抗-GAPDH单克隆抗体1∶1 000稀释，抗体均购自Santa Cruz公司。孵育结束后洗膜，加二抗室温孵育1 h，二抗使用浓度如下：HRP标记的羊抗-鼠IgG 1∶5 000稀释，HRP标记的驴抗-兔IgG 1∶5 000稀释，二抗均购自Sigma公司。孵育结束后洗膜。用化学发光显色试剂盒Immobilon Western(Millipore公司)暗室显影。

1.2.6 Real-time PCR试验 采用HBV实时荧光定量试剂盒(上海科华生物工程有限公司)检测转染后分泌到培养基上清液中的HBV DNA载量，具体操作步骤以及扩增条件按照产品说明书进行，PCR仪(ABI7500)。

1.2.7 药物敏感试验 感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)转染Huh7肝癌细胞系12 h后，换成含不同浓度拉米夫定(0、0.5、1、2 μg/mL)的培养基和不同浓度阿德福韦酯(0、0.5、1、2 μg/mL)培养基，继续培养36 h，分别收集上清液和细胞，检测核酸复制水平和蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 HBV 阿德福韦酯耐药株基因组的克隆 收集7份HBV 阿德福韦酯耐药患者血清，提取HBV DNA。以提取的HBV DNA为模板，采用高保真性聚合酶进行扩增。PCR扩增后与载体连接，转化大肠杆菌TOP10并涂板，挑取单克隆酶切鉴定，结果显示：在载体中插入了一个大小约3 200 bp的DNA片段，阳性克隆送测序。测序结果BLAST分析显示，克隆到的这株HBV，基因组的C、X、P和S区4个ORF区均完整无致死性突变，但在反转录区181位置出现了A→T的突变，表明克隆的这株HBV发生了阿德福韦酯的基因型耐药，将克隆到的这株阿德福韦酯耐药的HBV全长基因组命名为pHBV(RT A181T)。

以克隆到的pHBV(RT A181T)为模板进行亚克隆，通过SOE-PCR构建1.3倍体HBV感染性克隆，将构建的亚克隆1.3倍体HBV重组质粒以及空载体pBluescript KS(+)进行酶切鉴定，1.3倍体HBV重组质粒单酶切后呈线性片段，约7 000 bp，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后可见3 000 bp位置和接近4 300 bp位置有两条明显的条带，即载体pBluescript KS(+)和目的片段HBV1.3，证实1.3倍体HBV重组质粒构建成功,命名为pHBV1.3(RT A181T)。

2.2 感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)的体外复制

2.2.1 转染细胞表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg) 为了验证感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)能否在Huh7细胞中表达HBsAg、HBcAg，本研究进行了转染实验。感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)转染Huh7细胞48 h后，分别收集转染pHBV1.3(RT A181T)Huh7细胞培养上清液以及转染细胞，同时以未转染质粒的Huh7细胞为阴性对照，转染pHBV1.3(C)的Huh7细胞为阳性对照。免疫印迹实验结果显示：和阳性对照一样，转染pHBV1.3(RT A181T)的Huh7细胞的均明显表达蛋白HBsAg、HBeAg，而阴性对照无相应蛋白表达。

2.2.2 转染细胞分泌HBV DNA 为检测转染细胞是否分泌HBV颗粒，利用荧光探针PCR法检测培养上清液中HBV DNA的载量，结果显示：和阳性对照一样，转染pHBV1.3(RT A181T)的Huh7细胞上清液中HBV DNA的滴度达到106copy/mL，而阴性对未检测到HBV DNA。

2.3 抗病毒药物敏感性检测 为检测转染pHBV1.3(RT A181T)的Huh7细胞对药物的敏感性，将抗病毒治疗药物拉米夫定、阿德福韦酯加入到pHBV1.3(RT A181T)的Huh7细胞中。在加入拉米夫定后，HBV感染性克隆表达的蛋白HBsAg、HBeAg明显受到抑制，且与药物剂量正相关。而加入阿德福韦酯后，HBV感染性克隆表达的蛋白HBsAg、HBeAg不受抑制。实验表明，所构建的感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)转染Huh7后，对拉米夫定敏感，对阿德福韦酯耐药。

3 讨 论

此前的报道中，构建HBV感染性克隆采用的方法一般都是以扩增的HBV 基因组短片段基础上，通过几次酶切连接，拼接成HBV感染性克隆[10-11]。这种方法耗时耗力，还受到酶切效率及酶切特异性的限制，很难精准构建合适起止位点的1.3倍体HBV感染性克隆。SOE-PCR技术采用具有互补末端的引物,使模板链之间形成了重叠区域,从而在随后的延伸过程中沿着重叠部分延伸,将两条具有部分重叠区域的模板链拼接起来[12-13]。该技术能够对目的基因进行快速、方便的片段重组,并且不需要内切酶和连接酶处理,利用该技术也能快速地将两条短片段合成一条长片段[14]。通过精巧的引物设计，在线性HBV全基因组序列前面增加了一组内源性的HBV增强子和启动子，由此构建的pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆转染Huh7细胞后，将依赖自身启动子启动转录翻译，这样可以充分反映HBV病毒株的自身转录情况，有利于研究 HBV 复制和转录翻译的全过程。

在本研究中，从HBV 阿德福韦酯耐药患者血清中扩增得到1株完整的HBV基因组，经局部系列比对基本检索工具分析显示，该株病毒基因组的C、X、P和S区4个ORF区均完整无致死性突变，并且在反转录区181位置出现了A→T的突变，表明发生了抗病毒药物阿德福韦酯基因型耐药。以克隆到的HBV全基因组为模板，通过SOE-PCR快速构建了1.3倍体HBV感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)。pHBV1.3(RT A181T)是完整的病毒复制体，包含了5′末端增强子EnhⅠ、EnhⅡ、复制起始位点(DR1和DR2)、前基因组转录起始位点、X开放读码框等，可转录产生3.5、2.4、2.1、0.8 Kb等所有HBV转录产物[15-16]。

最后，将pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆转染Huh7细胞系。通过免疫印迹实验和real-time PCR等方法，验证了感染性克隆核酸复制及特异性蛋白合成的能力，结果显示构建的pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆具备完整的核酸复制及蛋白合成能力。而且，该感染性克隆对抗病毒药物拉米夫定敏感，对抗病毒药物阿德福韦酯耐药。因此，构建的pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆可用于HBV基础研究及临床抗病毒药物耐药研究。

本研究将pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆瞬时转染Huh7细胞株，HBV在细胞内的复制以及相关蛋白的表达在转染48 h后达到峰值，随着时间的推移病毒的复制以及相关蛋白的表达都逐渐下降，因此将pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆稳定转染Huh7细胞株,构建稳定表达的细胞株将是下阶段实验的重点，为进一步研究HBV的结构和功能、表达与调控、病毒与宿主的关系、抗病毒药物的筛选提供研究工具。

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Construction of infectious clone of HBV adefovir-resistant strain RT A181T and its expression in Huh7 cells*

ZHAOJianhua,LURenfei△

(DepartmentofClinicalLaboratory,NantongMunicipalThirdPeople′sHospital,Nantong,Jiangsu226006,China)

Objective To rapidly construct hepatitis B virus(HBV) adefovir(ADV)-resistant strain(RT A181T) infectious clone by using SOE-PCR,to observe the expression of recombinant plasmids in Huh7 cells and to establish the in vitro cell model of HBV ADV-resistant strain(RT A181T).Methods The conservative primers were designed,the full-length HBV genome was amplified from serum in the patients with ADV-resistant chronic hepatitis B.Then,the 1.3-fold genome-length infectious clone pHBV1.3 was constructed by using the SOE-PCR technique,which was transfected into human hepatoma cells Huh7 cell line.ELISA,Western Blot and Real-time PCR were adopted to detect infectious cloning replication and expression,meanwhile the antiviral drugs lamivudine(LAM) and ADV were used to verify the infectious clone copy and inhibition of expression.Results The HBV ADV-resistant infectious cloning plasmids pHBV1.3 was successfully constructed.This plasmid could be effectively replicated,transcripted and expressed in Huh7 cell lines.LAM could effectively inhibit the replication and expression of the infectious clone,while ADV could not inhibit the replication and expression of the infectious clone.Conclusion The constructed infectious clone plasmids pHBV1.3(RT A181T) of HBV ADV-resistant strain can efficiently replicate and express protein in vitro,its transfected cells can be used in the study of HBV replication mechanism and antiviral study.

hepatitis B virus; adefovir; drug resistance; infectious clone

江苏省南通市卫生和计划生育委员会资助项目(WQ2014038，W201217)；江苏省南通市科技局资助项目(HS2014062)。

赵建华，男，副主任技师，主要从事临床微生物研究。△

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.010

A

1673-4130(2016)23-3266-03

2016-06-02

2016-07-22)