脊索细胞特异性标志物研究进展

刘卓超　孟祥超　张兴凯



脊索细胞特异性标志物研究进展

刘卓超孟祥超张兴凯

椎间盘退变(尤其是其中髓核改变)与腰背痛密切相关。合适的标志物可以准确地将脊索细胞与椎间盘内其他细胞进行区分，以便于对其起源分化及形态结构进行深入了解并探索其在椎间盘退变治疗中的应用。目前发现在脊索细胞内特异性表达且对其生存有重要作用的特异性标志物包括低氧诱导因子-1(HIF-1)、葡萄糖转运因子-1(GLUT-1)、Shh蛋白、Brachyury蛋白、角蛋白(KRT)-8/18/19及CD24。此外，通过基因芯片技术检测到可能的脊索细胞特异性标记物，由于其作用尚未被证实，故仅可作为备选标志物。该文就脊索细胞特异性标志物研究进展作一综述。

脊索细胞；椎间盘退变；髓核细胞；软骨样细胞；标志物

据统计，全世界约有80%的人在一生中至少有1次腰背痛的经历[1]。全球疾病负担(GBD)研究显示，1990年因腰背痛而导致残疾的人数为5 800万，然而到了2010年因此致残人数增至8 200万[2]。椎间盘退变是造成腰背痛的主要原因，目前临床治疗的方式主要包括保守治疗(消炎治疗、理疗等)和手术治疗(腰椎融合术、人工椎间盘置换术等)，虽能缓解症状，但同时也会降低相应节段的活动度并引起邻近节段退变，无法从根本上治愈这一疾病[3]。

椎间盘由外周纤维环、上下软骨终板及中间富含蛋白聚糖的胶冻样髓核3部分组成[4]。伴随着椎间盘退变的发生，髓核内细胞由最初的脊索细胞逐渐转变为软骨样细胞，这一形态学改变被认为是退变开始的标志[5]。因此，如何鉴别脊索细胞成为其相关治疗研究的首要问题。本文就脊索细胞特异性标志物作一综述，并根据脊索细胞在椎间盘退变中的作用探讨其在治疗中的价值。

1　脊索细胞来源

关于成人椎间盘内髓核细胞的来源，长期以来一直存在争议。在早期椎间盘中，髓核主要由直径为25～85 μm的脊索细胞组成。随着年龄的增长，脊索细胞逐渐消失并被直径约为10 μm的软骨样细胞所取代[4]。近年来有研究[6-7]将Shh基因和Noto基因作为启动子激活脊索细胞特异性Cre重组酶并进行追踪，发现成年椎间盘髓核中所有细胞均来源于脊索。而脊索细胞特异性Brachyury蛋白在髓核中大量表达，也从另一方面证明了此说法[8]。尽管这些髓核细胞形态不同，但这只是由于它们物质代谢活动不同或处于细胞发育不同阶段。另有学者[9]认为髓核中的软骨样细胞是由邻近软骨终板中的软骨细胞迁移而来，但目前更多的证据还是指向脊索才是它们共同的起源组织。

2　脊索细胞特异性标志物

2.1与脊索细胞生存相关的标志物

椎间盘是人体最大的无血管组织，在成年人椎间盘中离髓核最近的血流供应为相距7～8 mm的一些小血管[10-11]，因此髓核细胞长期处于低氧状态。由于脊索细胞长期生存于低氧环境中，它具有一些帮助其适应这种低氧环境的特殊物质来改变自身的代谢与能量供应，这些物质可以作为脊索细胞特异性标志物。

2.1.1低氧诱导因子-1α与葡萄糖转运因子-1

在氧含量正常的情况下，机体大多数细胞中的低氧诱导因子-1α(HIF-1α)会被26S蛋白酶体分解，且HIF-1α的活性会受低氧诱导因子抑制因子(FIH)的调节[12]。但在脊索细胞内，无论氧含量多少，HIF-1α均会持续表达[13-14]。HIF-1α可以上调葡萄糖转运因子-1(GLUT-1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的表达[15]，促进脊索细胞充分利用糖酵解供能[16]，使其可以在低氧环境下生存。GLUT-1与HIF-1α均在脊索细胞内特异性表达，且对其在低氧环境下生存至关重要[17-18]，所以可以作为脊索细胞的特异性标志物。

2.1.2Brachyury蛋白

Brachyury蛋白作为一种转录因子对于胚胎时期中胚层，尤其是脊索的发育极为重要[19-20]。现已通过多种方法证实Brachyury蛋白在脊索细胞内表达[8,19,21]。Smolders等[22]研究发现，与软骨发育正常犬相比，软骨发育不良犬的椎间盘更易发生退变，同时其中的脊索细胞消失，取而代之的是软骨样细胞，而该细胞中Brachyury蛋白表达水平较脊索细胞显著降低。Tang等[20]对健康与退变髓核进行免疫细胞化学染色，发现Brachyury蛋白表达仅存在于健康髓核中，并在后续实验中通过流式细胞技术进行了验证。尽管目前尚无对Brachyury蛋白与椎间盘退变之间因果关系的具体研究，但该蛋白值得引起关注并可作为脊索细胞的特异性标志物。

2.1.3Shh蛋白

Shh蛋白在脊索中特异性表达，对于脊索细胞正常功能十分重要[23-24]。尽管Shh蛋白在脊索细胞内的表达随着椎间盘成熟而逐渐减少，但通过Wnt信号转导通路激活Shh蛋白可促进Brachyury蛋白表达和聚集蛋白聚糖合成[25]，这表明Shh蛋白可以通过调节细胞外基质组成和脊索细胞活性对椎间盘起到保护作用。鉴于Shh蛋白在脊索细胞内的特异性表达和阻止椎间盘退变的潜能，它可作为脊索细胞特异性标志物。

2.1.4聚集蛋白聚糖与Ⅱ型胶原比值

脊索细胞外基质主要含有蛋白聚糖(主要为聚集蛋白聚糖)与胶原(主要为Ⅱ型胶原)，其中聚集蛋白聚糖可以通过水化作用帮助髓核抵抗纵向压力。随着年龄的增长，聚集蛋白聚糖含量下降引起髓核抵抗纵向压力功能受损，使其无法将压力均匀分散至四周，导致局部压力过大，引起纤维环破裂[26-27]。尽管软骨细胞外基质中也有聚集蛋白聚糖与Ⅱ型胶原，但其比例远低于脊索细胞(分别为2～3∶1、>20∶1)[28]。鉴于脊索细胞与椎间盘内其他细胞聚集蛋白聚糖与Ⅱ型胶原比值存在明显差异，所以聚集蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的比值可作为鉴别脊索细胞的标准之一。

2.1.5其他标志物

角蛋白(KRT)作为一种细胞中间丝，常存在于上皮细胞中。它是细胞骨架重要组成成分，在维持细胞结构完整、调节细胞大小、调节Fas介导的细胞凋亡及蛋白合成等多个方面有重要作用[29]。脊索是胚胎早期主要的轴向结构，随着胚胎的逐步发育，脊索细胞在邻近成骨细胞连续静水压的作用下逐渐由发育中的椎体中央迁移至椎间盘内。KRT的细胞骨架功能可以帮助脊索细胞发生上述位置结构改变[30]。同时KRT-8、KRT-18、KRT-19在脊索细胞中特异性表达。因此，它可作为脊索细胞特异性标志物。

CD24是在B细胞与T细胞成熟过程中表达于细胞表面的一类表面蛋白，它在人与大鼠各个生长阶段的脊索细胞中均存在特异性表达[20,31]，且胚胎时期小鼠体内CD24阳性细胞可以自然分化成为具有脊索细胞特征的细胞[32]。总之，CD24与脊索细胞密切相关，可以作为脊索细胞特异性标志物将其与纤维环细胞、软骨细胞等椎间盘内其他细胞区分开。

2.2应用基因芯片技术发现的标志物

应用基因芯片技术得到的某些脊索细胞特异性表达的基因可能存在RNA与蛋白表达水平不一致的情况，因此应用此技术选择脊索细胞特异性标志物时需谨慎。

Minogue等[33]对牛脊索细胞进行基因芯片检测，发现突触相关蛋白-25(SNAP-25)、KRT-8/18/19、钙黏蛋白2(CDH2)、脑酸溶性蛋白-1(BASP-1)及硬化蛋白域蛋白(SOSTDC)1在牛脊索细胞中特异性表达。值得注意的是，SNAP-25、KRT-8、KRT-18、CDH2、SOSTDC与人椎间盘退变相关，其mRNA表达水平随着退变的发展逐渐减少。他们[34]随后的实验通过基因芯片与实时定量聚合酶联反应(qRT-PCR)技术检测发现，人脊索细胞中特异性表达的物质包括Pax1蛋白、叉头蛋白F1(FOXF1)、碳酸酐酶Ⅻ(CAⅫ)、β链血红蛋白(HBB)与卵固蛋白 2(OVOS2)。Power等[35]对CAⅫ进行了深入的研究，证实脊索细胞内CAⅫ基因在RNA与蛋白水平均存在特异性表达。CAⅫ对于酸碱平衡的维持十分重要，由于椎间盘髓核主要依赖糖酵解供能且缺乏血供，因此有大量乳酸产生并无法运出，导致椎间盘内乳酸堆积。在脊索细胞内的CAⅫ可能在缓冲酸性环境过程中发挥重要作用，因此其可能与脊索细胞存活相关，但这需要进一步的实验进行证实。

Tang等[31]研究发现，CD24、CD155、CD221、Brachyury蛋白、脑富含膜附着信号蛋白-1(Basp-1)、神经软骨蛋白(NCDN)及神经菌毛素-1(NRP-1)在大鼠脊索细胞中特异性表达。随后他们[20]研究证实， Brachyury蛋白、Basp-1、NCDN、NRP-1、CD24及CD221在人脊索细胞也特异性表达。但Rodrigues-Pinto等[30]对此存在异议，认为Basp-1在人椎间盘纤维环、椎体中也有表达。

综上所述，HIF-1、GLUT-1、Shh蛋白、Brachyury蛋白、KRT-8/18/19及CD24可作为脊索细胞特异性标志物[21,30,36]。其他可能的特异性标志物包括CAⅫ、SNAP-25、SOSTDC、CDH2、FOXF1、Pax1、OVOS2、HBB、CD155、CD221、Basp-1、NCDN及NRP-1等[20,33-34]，但目前尚缺乏对以上备选标志物在椎间盘退变中所起作用的相关深入研究。

3　脊索细胞在抑制椎间盘退变中的作用

由于椎间盘内细胞需要合成大量细胞外基质，但它本身可以从周围环境中摄取的营养物质却很少，所以容易发生退变[37]。脊索细胞数量减少与椎间盘退变密切相关，而造成细胞数量减少的原因主要是细胞凋亡和坏死[38-39]。Erwin等[27,40-41]研究发现，脊索细胞分泌的细胞因子可以明显降低由白细胞介素(IL)-1/Fas配体(FasL)诱导的细胞凋亡率和死亡率(凋亡率由46.26%降至32.00%，死亡率由8.81%降至4.11%)；对含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)活性进行检测发现，Caspase-3、Caspase-7表达受到抑制。这证明脊索细胞可以通过分泌细胞因子抑制Caspase-3、Caspase-7活性，从而抑制IL-1/FasL介导的细胞凋亡[27,42]，在椎间盘退变中起到抗凋亡的作用。此外，脊索细胞还可以通过促进细胞外基质合成[43]和抑制椎间盘中血管神经长入[44-45]等抑制椎间盘退变的发生。

4　脊索细胞在治疗椎间盘退变中的应用

针对椎间盘退变中的各种改变，可采取相应措施阻止退变进一步发展。现阶段关于椎间盘退变的治疗仅限于对症治疗，并未涉及纠正其病因、恢复椎间盘结构和功能而使椎间盘得到修复与再生[46]。脊索细胞作为一种原始干细胞，可以通过抑制细胞凋亡及促进基质合成方式来缓解椎间盘退变的发生发展，因此可采用现代手段将脊索细胞或其分泌的细胞因子注入病变椎间盘中，从而延缓、阻止甚至逆转病变发展，在根本上解决引起疾病的原因，而不仅仅是缓解临床症状[10,43]。一些血小板源性生长因子如转化生长因子-β1(TGF-β1)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)可以延缓椎间盘退变发生，但其半衰期较短，因此应用于椎间盘退变治疗受到限制。有学者[47]认为可以将富含血小板血浆与脊索细胞共同注入椎间盘内使其发挥协同作用，并通过实验证明了此方法对修复早期椎间盘退变的可行性。为缓解椎间盘源性疼痛，可以通过恢复椎间盘内蛋白聚糖含量或注入脊索细胞分泌因子(如臂板蛋白3A、Noggin等)，达到抑制退变过程中血管与神经生长的目的，还可通过刺激髓核细胞持续分泌蛋白聚糖，恢复蛋白聚糖“隔离带”，进而阻止血管神经生长[44]。

5　存在问题

尽管生物治疗有恢复椎间盘结构、功能的可能性，但椎间盘自身仍存在可获取的营养物质极其有限、缺乏血供及自我修复能力较差等一系列问题，且如何获取足够量的脊索细胞也是困扰学者们的一大问题，所以现阶段要想将该方法应用于临床仍存在较大困难[4,48]。目前有学者尝试通过采用灭活猪脊索细胞粉末诱导人多能干细胞向脊索细胞方向分化，从而为细胞移植治疗提供足量脊索细胞。而由人多能干细胞分化得到的脊索细胞可最大程度地消除安全隐患[49]。但当椎体软骨终板出现硬化时，椎间盘内的微环境会发生改变，此时便无法通过注入细胞及生长因子进行治疗。因此，治疗时机的选择十分重要。需要注意的是，在进行生物治疗的同时应补充营养物质并留意生物力学因素等的影响[48,50]。尽管存在一些问题，但脊索细胞作为一种髓核细胞前体细胞，为椎间盘退变治疗提供了新思路。

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(收稿：2016-02-15; 修回：2016-04-23)

(本文编辑：卢千语)

国家自然科学基金(81071502)、 上海市科委科研项目(15ZR1437600)

200025，上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科

张兴凯E-mail: zxk68@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.05.008