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猪圆环病毒地方株的分离与测定

2016-03-09胡元春河南省新乡市动物疫病预防控制中心453000

当代畜禽养殖业 2016年1期
关键词:病料圆环培养液

胡元春 河南省新乡市动物疫病预防控制中心 453000

猪圆环病毒地方株的分离与测定

胡元春河南省新乡市动物疫病预防控制中心453000

猪圆环病毒病 (PCVD)是由猪圆环病毒2型(PCV2)引起的猪传染性疾病,该病的主要特征为患猪体质下降、消瘦、贫血、黄疸、生长发育不良、腹泻、呼吸困难和母猪繁殖障碍。猪圆环病毒是目前发现的一种最小的哺乳动物病毒,包括两个血清型,即PCV1和PCV2,其中PCV2有致病性。

现有6份临床症状疑似PCVD的病毒料,需要分离病毒,建立PCR及ELISA方法进行检测。

1 材料与方法

(1)试验材料。试验病料来自不同地区疑似被PCV2感染猪的肺、淋巴结和肝等器官的组织病料。试验试剂及主要仪器有胰酶、D-hanks液PCR扩增仪、低温高速离心机、台式离心机、电泳仪和凝胶成像系统。

(2)试验方法。细胞培养于37℃、5%CO2的环境中。细胞生长液为含8%血清的DMEM培养液,维持液为含4%的DMEM培养液。2天传代1次。将病料组织剪碎,用Hanks液研磨并制成5~10倍乳悬液反复冻融,离心 0.22μm微孔过滤后-20℃保存。当细胞长满50%~70%左右,将处理好的病毒上清液滴入细胞瓶内,在37℃、5%CO2培养半小时,倒掉病毒液,然后加入4%DMEM维持液。当细胞长满单层后,细胞传代方法操作换8%DMEM维持液,盲传3代,未出现细胞病变。含有病毒液的细胞瓶存放于-20℃冰柜中,冻融3次后,收取病毒液密封冻存于-20℃备用。从病毒液上清中提取DNA,加入PCR反应体系中。体系为25μl。上游引物P1:5’-TTCGGTACCAGCTATGACGTATCCAAG-3’;下游引物P2:5’-GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3’;片段751bp。94℃ 3分钟,94℃ 30秒,55℃ 30秒,72℃ 1分钟,循环35次。72℃最后延伸10分钟。

本实验按照参考文献的方法介绍,处理待测样品。用酶标仪在450nm处测OD值。

2 结果与分析

样品在1%琼脂糖凝胶电泳后,得到750bp左右的特异性核苷酸片段,与实验预期结果一致。实验病毒料的OD值与阴性样本的OD值之比为2∶7,实验结果为阳性,与实验预期结果一致。

3 讨论

仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和多种疫病都与PCV2相关联。现在主要应用PCR等分子生物学方法诊断PCV2,因此对不同地区来源的PCV2毒株基因组序列确定其基因序列变异程度,可以为建立有效的PCV研究方法提供依据。

PCV2单独感染时的症状和病变并无特征性,必须借助实验室手段才能进行确诊。目前研究较多的实验室检测技术有间接免疫荧光(IFA)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、单克隆抗体以及多种聚合酶链式反应(PCR)技术等。与传统方法相比,PCR具有较高的敏感性和特异性,而且操作简便,是最常见的诊断方法。本实验的检测结果为阳性,初步鉴定该病毒为猪圆环病毒。但有关该病毒料的其他一些生物学特性尚待进一步鉴定。

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