PCR实验室的污染及控制措施

郭利华

(成都艾迪康医学检测实验室有限公司　610037)



PCR实验室的污染及控制措施

郭利华

(成都艾迪康医学检测实验室有限公司610037)

目的分析PCR实验室污染途径。方法针对PCR实验室不同的污染途径采取不同的控制措施。结果通过一系列控制措施，达到了有效预防和控制污染的发生。结论PCR实验由于具有高灵敏度，容易产生污染，必须针对不同污染途径采取不同控制措施,以避免污染产生的风险。

聚合酶链反应；实验室污染；控制措施

聚合酶链反应(PCR)技术是20世纪80年代慢慢发展起来的一种体外基因扩增技术。该项技术在人体外可在很短的一定时间内将极微量的靶核酸扩增上百万倍，得到大量特定目的基因片段。随着科学技术的发展，PCR技术具有特异、快速、敏感、产率高、易自动化、高通量、简便等突出优点，已成为临床实验室常用的操作技术之一[1-2]。PCR技术在医学领域重点应用于临床医学和预防医学中[3]，大多数病原体都可通过PCR检测为人类疾病的防治提供新的检测手段，但在实际PCR实验过程中极易发生污染，引起结果的假阳性。为保证结果的可靠性和准确性，结合有关资料和工作经验分析PCR实验室污染产生的途径及控制措施。

1　PCR实验室常见污染途径

由于PCR技术敏感性特高，所以要求更高，影响因素也非常多，从样品开始采集到结果报告发出，任何一处细小的失误都会造成检测结果的偏差，极其微量的污染都容易导致样品出现假阳性结果。产生污染的主要途径包括4个方面：(1)是PCR试剂污染。主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样器、容器、水及其他溶液被PCR核酸模板污染。(2)是标本间交叉污染。①收集标本的容器被污染。②标本放置时，由于密封不严溢于容器外。③容器外黏有标本造成相互间交叉污染。④标本核酸模板在提取过程中，由于吸样器污染导致标本间污染。⑤有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶而扩散导致污染。(3)是PCR扩增产物污染。这是PCR中最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染就可形成假阳性。(4)是实验室中克隆质粒的污染。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的实验室，这个问题也比较常见。克隆质粒在单位容积内浓度高，另外在纯化过程中需要较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及其具有很强的生命力，其污染可能性也很大[4]。由于一旦发生基因实验室污染，该实验就必须要停止，花费大量物力、人力直到寻找污染源为止，而且实验报告结果必须作废，需重新操作实验，结果才可靠。

2　PCR污染的控制措施

2.1工作区域的严格划分

2.1.1各个实验区域设置合理，根据《CNAS-CL36医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》要求，合理分隔实验室。将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意标本处理及PCR产物的鉴定应与其他步骤严格分开。最好能划分：标本处理区，PCR反应液制备区，PCR循环扩增区，PCR产物鉴定区。其实验用品及吸样枪应专用。实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA[5]。

2.1.2各个实验区域要对不同设备、物品颜色有明显的标记，如各区域使用专门的工作服、工作鞋、垃圾桶、拖把、抹布、笔等，避免不同工作区域内的设备、物品混用。

2.2使用一次性用具吸头、离心管、无粉尘手套、口罩等均为一次性使用。

2.3规范的系统设置设置规范的空调通风系统，尽可能采用全送全排空调系统。在进入各个操作区域需要严格单一流向进行，即试剂准备和贮存区→样品制备区→PCR扩增区→扩增产物分析区，不得逆行。

2.4污染监测需要设立阳性对照、阴性对照，进行重复试验，选择不相同区域的引物进行PCR扩增等，做好污染监测，以便采取措施防止和消除污染。

2.5规范操作

2.5.1PCR实验室人员必须进行上岗培训，取得外部和内部上岗证后，方可从事基因扩增检验工作。

2.5.2在操作中勤换手套，且不能与管盖内面接触。吸头、离心管装上滤嘴才能用。

2.5.3要正确操作相关仪器设备，认真按照制订的合理、科学的操作规程操作相关仪器设备，避免产生气溶胶污染。

2.5.4取样、加液(标本、反应液等)时应先高速离心将管盖上液体沉于管底，动作轻快、以避免飞溅和产生气溶胶污染环境。取样应就近操作，避免较远距离移样。

2.5.5若在各区域操作发生试剂、样品的外溅，此时工作人员先隔离其他未被污染的相关物品，戴上手套和生物防护装置，用吸水纸吸干液体，对污染处用2 000 mg/L的次氯酸钠消毒液覆盖30 min，再用75%乙醇擦拭2遍，等试验结束后用紫外线照射39 min[6]。

2.5.6若发生实验室工作人员工作服、鞋、帽被污染时，必须立即脱掉并包裹好进行消毒处理，换上另外消毒好的工作服、鞋、帽等后方可继续工作。如果污染重则停止当天的下一步工作或另换其他具有资质的人员进行工作。

2.5.7清洁工作及时、准确，每次实验前后用500 mg/L的含氯消毒液擦拭地面及工作台面，75%乙醇擦拭仪器设备，再用紫外线照射整个实验区域及设备，时间不低于30 min。实验室内的样品溶液和扩增产物产生的气溶胶是重要的污染源，故PCR实验室要经常通风换气和消毒。当试验结束后产生的废弃反应管、枪头等废弃物应置于2 000 mg/L的含氯消毒液中浸泡12 h以上。废弃物需要经高压灭菌后按医疗废物进行消毒处理，避免污染实验环境。

2.6科学合理的管理根据实际情况，制订科学、合理的关于PCR相关制度文件、程序文件、标准操作规程及记录表格等文件，文件相关内容一定要有科学性、前瞻性、、严谨性，并且操作性强，以便工作人员现场查阅和培训学习。

目前PCR技术广泛应用，已经得到长足发展，成为临床一些疾病诊断和预防控制领域的有力工具。为避免在PCR实验室内出现污染、假阴性及假阳性结果等现象，确保检验结果准确性，实验人员应该不断提升检测能力，具备应对污染的能力，控制污染蔓延，将损失降到最小。

[1]Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR[J].Nueleic Acids Res，1994，29(9)：51-52．

[2]朱永芳.实时荧光聚合酶链式反应检测技术[M].北京：中国计量出版社，2013.

[3]林万明.PCR技术操作和应用[M].北京：人民军医出版社，2012.

[4]Munoz N,Bosh FX,de Sanjose S,et al.Epidemiogic classification of human papillomavirus types associated with cervical Cacer[J].N Engl J Med,2003,348(6):518-527.

[5]黄雅，冯玉昆.HPV亚型检测与宫颈癌筛查[J].医学综述，2007,13(19)：1453-1454.

[6]Herrero R,Castellsague X,Pawlta M,et al.Human papillomaviruses and oral caner:the international agency for research on cacer multcenter sdudy[J].J NATL Cancer Int,2003,95(1):1772-1783.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.067

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1673-4130(2016)16-2354-02

2016-02-14

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