分子免疫遗传学在输血医学中的应用▲

莫秋红 申卫东 周 燕

(南宁中心血站暨南宁输血医学研究所，南宁市 530007，E-mail：qiuhongmo@126.com)

综 述

分子免疫遗传学在输血医学中的应用▲

莫秋红 申卫东 周 燕

(南宁中心血站暨南宁输血医学研究所，南宁市 530007，E-mail：qiuhongmo@126.com)

随着输血技术及相关领域突飞猛进的发展，输血医学已成为临床医学中不可或缺的重要组成部分，这一学科在现代医学中备受关注并得到了重新认识。基因革命时代的到来，使得输血医学中的配血方式在慢慢发生改变。本文就以DNA检测技术为基础的分子免疫遗传学在输血医学中的应用进行综述。

血型；基因检测；凝集法；输血医学

自从20世纪初ABO血型被发现后，由国际输血协会正式公布的红细胞血型系统有33个，包括339个抗原，其中297个抗原属于簇，其他属于集合[1]。1986年MN血型 GYPA基因成为第一个被克隆的血型基因，随后对所有编码血型系统的基因或基因家族(如MNS、Rh和Ch/Rg系统)都完成了克隆、测序工作，明确了绝大部分血型抗原相关的分子基础。除一些罕见突变之外，血型的分子基础主要是单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism，SNP)。大量血型分子信息，为实现应用DNA检测技术预测血型的表现型提供了基础。目前输血医学进入基因革命时代，输血医学中血液的配血方式也将发生改变[2]。另外，基因技术在检测D-接合性、非侵入型胎儿血型等方面更显示出其独特的优势。本文就以DNA检测技术为基础的分子免疫遗传学在输血医学中的应用进展作一综述。

1 红细胞凝集法和DNA检测技术

1.1 红细胞凝集法 红细胞凝集法是检测血型抗原和抗体的经典方法，该技术在输血医学领域里已经沿用了几十年，其特点如下：(1)应用价值：红细胞凝集法一直作为检测红细胞表面血型抗原的“金标准”服务于输血机构，其实验操作简单、快速，对设备要求不高，只要操作正确便可获得具有较高特异性和灵敏性的结果，基本满足大部分输血患者的临床要求。(2)检测试剂：抗体试剂从被免疫的患者或献血者中获得(多克隆或单克隆)，或从被免疫的小鼠中获得(单克隆)。但原材料具有生物危害，并且数量逐渐减少。且经批准认证的商品化试剂价格不断增长，而很多抗体试剂并非经商业化便可买到，通常是来源于实验室间的交换。此外，某些抗体剂量很少，或者反应较弱。(3)局限性：红细胞凝集法是一种主观性检测，依赖于高特异性的抗体试剂；劳动密集型检测只能分析少量献血者的血型，从而限制了稀有血型血液的库存量；对于胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of fetus and newborn，HDFN)风险只能间接预测和评估；难以确认近期输血和免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G型直接抗球蛋白试验阳性(direct antiglobulin test+，DAT+)患者的红细胞分型；难以区分同种抗体和自身抗体，影响血型分型；无法识别RhD接合性。

1.2 DNA检测技术 其特点为：(1)应用优势：可实现自动化；可对一个标本同时检测多个血型标记物，实现高通量；可通过计数机的DNA配型来选择与患者配合的血液。(2)检测试剂：探针和引物为靶特异性，成本低，可大量生产，方便购买。(3)局限性：该技术只是预测抗原分型，特别是稀有血型，还需用红细胞凝集法再做确认；实验过程耗时长；DNA和红细胞凝集法检测结果可能不一致；体细胞和血细胞获得DNA的结果可能不一致；多种基因分型可能得到相同的表型，特别是null表型；还存在很多尚未知晓的等位基因。目前基因分型的结果只作为研究，尚未直接应用于临床。

2 血型基因分型及其临床应用

以往血型抗原和相应的特异性都是应用传统的免疫血清学方法或生物化学方法进行鉴定和研究，从20世纪90年代起，随着分子生物学技术的迅速发展，整个血型研究和应用领域很快进入分子水平，研究重点转向血型基因多态性的分子基础、组织特异性表达、结构和生物功能，以及在生命学科中的应用。

2.1 大量输血患者的血型检测 因疾病而需要长期输血或大量输血的患者，其外周血中存在献血者的红细胞，使凝集试验的红细胞分型既复杂又耗时，而且实验结果有可能不准确[3]。DNA检测技术可以克服这些问题。由于DNA检测的目标是所有等位基因的基因区域，即使存在少量献血者的DNA也会在PCR过程中被患者的DNA竞争抑制，可获得准确的血型结果。大量输注非少白细胞血液的患者也可以通过口腔拭子或尿沉渣提取DNA进行PCR，从而获得准确分型[4-7]。

2.2 DAT+患者的血型检测 自身免疫性溶血贫血或者红细胞表面覆盖IgG的患者，无法通过间接抗球蛋白试验完成对红细胞血型的鉴定。即使利用IgG去除技术，但去除效果往往不佳，并且可能破坏红细胞抗原，得到错误的结果。此时基因检测是一个可选择的可靠方法。

2.3 献血者血液筛选 血清学是以特异性的抗体试剂为基础的实验方法，没有分型试剂将不能完成血液筛选。为了克服试剂问题，基因分型可以代替血清学为患者筛选合适的血液。对于含有Dombrock、Colton、Kell(Jsa、Kpa)和Diego血型系统抗体的患者[8-11]，利用血清学方法找到合适的血液是非常困难的，因为这些血型对应的抗体虽然有潜在的临床意义，但是通常为弱反应，仅少数可在凝集试验中被检出，而且产生这些稀有血型抗体的血清中通常存在其他的同种抗体，即患者含有多重抗原的抗体，使得凝集试验的结果分析更加复杂[11]。DNA分析则远远超越了血清学凝集试验的血型分型能力。

2.4 RhD接合性检测 血清学检测红细胞表面抗原D、C/c和E/e，只能推测该样本RhD基因纯合子(D/D)或杂合子(D/-)的可能性。而分子生物学通过检测D阴性者的隐性等位基因，判断RhD基因的接合性。当母亲体内存在抗-D抗体，利用父亲的RhD基因接合性预测胎儿D血型，这在产前检查中是非常重要的。由于很多不同的基因事件会产生D阴性的表型[12-13]，所以必须采取多种基因检测方法来分析不同的基因事件，包括检测RhD基因缺失、37碱基对插入RhD假基因和D阴性RhD-CE-D杂交基因[14-15]，才能获得准确的RhD接合性。在产前检查中，常规用血清学方法检测RhD抗原，如果父亲是阳性的结果，需要进一步用DNA技术检测父亲基因的接合性(如纯合子或杂合子)。如果父亲是纯合子基因，其所有的孩子都是阳性，必须进行孕期监测。如果父亲有一个缺失RhD基因或无效RhD基因，胎儿可能是阴性，或不存在HDFN风险。能否排除胎儿新生儿溶血病风险，还需要通过检测胎儿血型来确定。

2.5 D抗原减少(weak D)和缺失部分D抗原决定簇(partial D)的鉴别 红细胞D抗原分型中，可能有2%个体为weak D或partial D变异体，这些变异体是由变异型RhD基因编码。不同生产厂家抗体试剂的差异及实验方法的不同(如试管法、固相法、凝胶法或自动分析仪)，与红细胞反应结果、D分型可能不一样。区分weak D和partial D与育龄妇女、临床输血密切相关。一般情况，partial D会产生抗-D抗体，而 weak D不会，所以partial D在输血治疗中应视为D阴性，该分型的妇女或患者也应视为Rh免疫球蛋白治疗方案的对象[16]。目前，常规的血清学检测试剂不能区分这两种分型，但检测RhD多个区域的基因分型可鉴别partial D和weak D。

2.6 胎儿血型鉴别 产前检查中，DNA基因分型对于判断胎儿是否遗传了父亲的抗原有着重要的作用。如果胎儿相应抗原是阴性，胎儿就不存在发生HDFN的风险，母亲也就不需要接受昂贵的侵入式监测和免疫调节药物治疗。胎儿的DNA可以从羊水或绒毛样本中的细胞获得，也可以在怀孕大约5周后，从母亲的血浆中获得胎儿DNA。从母亲外周血的血浆或血清中获得非细胞的游离胎儿DNA[17]，对非侵入性产前诊断、胎儿性别诊断、父系单基因遗传病起到突破性的作用[18-21]。母亲血浆内的胎儿DNA来源于合胞体滋养层细胞的凋亡[22]，随着胎龄的增长，DNA的浓度也相应增加，但分娩之后就快速被清除[17，19]，因此上一次怀孕产生的游离胎儿DNA不会影响到本次孕期的检测。定量PCR可以准确检测母亲血浆内的胎儿DNA，鉴定胎儿的D血型。

2.7 DNA血型分型用于试剂红细胞 红细胞血型基因分型可用于提高抗体鉴定试剂红细胞的品质[23]。通过DNA血型分型可以明确试剂红细胞的抗原是否“双倍剂量”，当患者血清中的抗体反应很弱时尤其重要，如S、D、Fya、Fyb、Jka、Jkb；抗血清缺乏或质量差不能筛选到合适试剂红细胞时，可通过基因分型预测抗原来选择，如Doa/Dob、Coa/Cob。只有品质好的抗体筛查或抗体鉴定的试剂红细胞，才能保证临床上有意义的抗体不被漏检。

2.8 减少同种免疫风险，优化库存管理 据有关统计分析，约13%的输血患者存在产生同种抗体的风险，多次输血的镰状红细胞贫血患者和已产生某种抗体的患者，更是增加了产生另外抗体的风险[24-25]。分子基因分型在输血医学中的应用，可对献血者进行多个血型位点的检测，通过电脑系统选择多血型抗原配合的血液给予患者，而这是一种具有重要意义的改变。多血型抗原配合的输血可以降低同种免疫，有利于提高医疗护理和输血效果。339个抗原都能完全配合只是理想状态，在实际的临床输血工作中，也没必要如此谨慎，因为并不是所有血型系统都具有临床意义，另外有限的库存也限制了每个患者所输注的红细胞血型配合程度。首先实现5个主要的抗原系统的配合，包括Rh(Cc、Ee)、Kell、Kidd(Jka/b)、Duffy(Fya/b)和Ss，其发生同种免疫的风险很高，而输血患者能接受更多血型配合的血液是更佳的选择。随着基因技术的发展，血液库存管理系统的完善，招募工作更集中于少数稀有血型的献血者，库存管理得以优化，患者可获得更多血型抗原配合的输血，可避免同种免疫。

3 DNA检测技术应用中的问题

DNA分析不是常规鉴定献血者ABO和RhD的选择方法。原因如下：凝集试验进行ABO正反定型时，天然的抗-A、抗-B提供了对照试验；采用高效标准的单抗进行ABO和RhD分型相对简单快速；目前输血前检测体系适合凝集试验。另外，D抗原弱表达的红细胞几乎都是C+或E+，一部分弱D患者通过输注D、C、E抗原阴性红细胞而获得安全治疗。因此，对于常规ABO和D检测来说，DNA检测更耗时、更复杂，且并未提高凝集试验的输血治疗效果。再者，某些突变导致A或B转移酶无活性而形成O型，如果标本中存在一个未知的无活性等位基因而产生ABO血型错误的风险，这样的风险在选择血液输血中是不能接受的。SNP分型只是预测表现型，有时不能准确反映红细胞表型。如基因表达抑制或基因无活性表达，以及尚未知晓的多态性，都可能得到假阳性。在临床输血前进行检测，如果患者发生同种免疫，产生临床有意义的抗体，DNA基因分型就不能代替抗体筛查和抗体鉴定。时间也是一个必须考虑的问题，从样本的DNA提取到数据结果，目前多重PCR系统为7个小时，即使检测时间可能在将来缩短，对于紧急输血的患者，也不适宜使用多个血型抗原配合的输血模式。

4 总 结

将分子技术应用于临床需要多领域的技术和知识，例如分子技术、基因结构和方法、血型分子基础、血液凝集技术、血型抗原表达、可影响基因分型的因素(如嵌合体)以及相关管理条例等，同时需要将DNA和血清学的结果进行综合分析，从而为临床解决问题。血清学凝集试验存在着某些缺陷，PCR检测技术作为辅助手段将成为一种强大工具，特别在D-接合性、非侵入性胎儿血型鉴定、镰状细胞性贫血患者配血上，比血清学更胜一筹。虽然目前分子生物学应用于输血行业仅限于血型参比实验室，随着高通量平台的建立和发展，基因检测将成为输血行业的主流，其可能从根本上改变输血前检测的程序，通过多个血型位点选择与患者抗原相匹配的血液，避免潜在的同种免疫，可明显的提高输血治疗效果。

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广西自然科学基金(2010GXNSFA013262)；广西卫生厅自筹课题(Z2010196)；广西南宁市科学研究与技术开发计划(201003048C-1)

莫秋红(1979～)，女，硕士，主治医师，研究方向：输血医学免疫学及分子生物学研究。

R 457.1

A

0253-4304(2016)01-0095-04

10.11675/j.issn.0253-4304.2016.01.29

2015-08-01

2015-10-20)