体细胞突变在醛固酮腺瘤发病中的作用

郑芳芳　朱理敏　高平进

200025　上海交通大学医学院附属瑞金医院高血压科,上海市高血压研究所



体细胞突变在醛固酮腺瘤发病中的作用

郑芳芳朱理敏高平进

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院高血压科,上海市高血压研究所

【摘要】原发性醛固酮增多症是继发性高血压的常见病因，可导致严重的心脑血管病变，影响患者预后。KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D基因体细胞突变通过影响不同的离子稳态，增加细胞内钙离子浓度，从而刺激肾上腺皮质球状带细胞分泌过多的醛固酮。该文主要介绍醛固酮腺瘤发病中上述基因体细胞突变的作用。

【关键词】体细胞突变；原发性醛固酮增多症；醛固酮腺瘤；离子通道

原发性醛固酮增多症(PA)是一种常见的继发性高血压。由于肾上腺皮质球状带(ZG)病变，分泌过多的醛固酮，导致水钠潴留和排钾增加。在首次确诊的高血压患者中，PA的发病率约为10%，而在难治性高血压中可能占到20%。与原发性高血压相比，PA患者发生糖脂代谢异常和心脑血管并发症的风险更高[4-5]。绝大部分PA患者为散发型，主要病因是醛固酮瘤(APA)和双侧肾上腺增生[6-7]。1%~10%的PA患者为家族型醛固酮增多症(FH)，分为FH-Ⅰ、FH-Ⅱ和FH-Ⅲ型。2011年，作为PA研究的一项突破性进展，Choi等报道了KCNJ5基因(编码内向整流钾通道Kir3.4)突变与APA和FH-Ⅲ的发病相关,PA的分子生物学机制逐渐引起关注。

1基因突变的发生率

Choi等通过全基因组测序技术，首次证实了编码内向整流钾通道Kir3.4的KCNJ5是APA的致病基因，在22例瑞典APA患者中，2例发生Gly151Arg突变,6例发生Leu168Arg突变。对来自英国和澳大利亚的73例散发型PA患者的研究发现，26.0%的患者存在Gly151Arg突变，13.7%存在Leu168Arg突变，另有1例少见突变位点delIle157。另一项纳入了瑞典、德国、澳大利亚和法国348例PA患者的研究发现，Gly151Arg和Leu168Arg的突变率分别为24.1%和20.4%，另有2例患者出现少见突变Glu145Gln[10]。来自法国、德国和意大利的474例PA患者中，Gly151Arg和Leu168Arg突变率分别为23.8%和13.7%[11]。总的来说，APA患者的KCNJ5突变率约为40%[12-13]， Gly151Arg和Leu168Arg是突变热点。

本研究组前期对168例中国APA患者的研究显示，KCNJ5基因的体细胞突变率高达76.8%，其中Gly151Arg和Leu168Arg的突变率分别为39.9%和35.7%，另有Thr158Ala和Thr148-Thr149insArg突变各1例[14]。另一项研究报道,中国APA患者KCNJ5基因突变率为75.4%[15]，与本研究组的结果接近。另外，中国台湾地区和新疆APH患者KCNJ5基因的突变率略低，分别为59.5%和45.7%[16-17]。日本APA患者KCNJ5基因突变率为65.2%[18]。目前，亚洲APA患者的KCNJ5基因突变率普遍高于其他地区[13]。主要原因可能是种族差异，但仍需多中心研究进一步明确。另一方面，不同中心的PA诊断和入选标准存在差异[12-13]。

对KCNJ5野生型合并低钾血症的男性PA患者的研究发现，P型三磷酸腺苷(ATP)酶家族成员ATP1A1基因[编码钠离子(Na+)/钾离子(K+)-ATP酶α亚单位]和ATP2B3基因[编码细胞膜钙离子(Ca2+)-ATP酶]体细胞突变与APA相关。德国、法国和意大利的308例APA患者中，有16例(5.2%)ATP1A1突变样本和5例(1.6%)ATP2B3突变样本[19]。另有2项国外研究显示，CACNA1D基因(编码L-型电压门控性钙通道的α1亚单位Cav1.3)体细胞突变与APA的发病也存在关联，其突变率分别为15.5%和7.8%[20-21]。

2基因突变与临床表型

研究显示，KCNJ5基因体细胞突变状态与APA患者的临床表型相关[9-11,14,18-19,22-23]。首先，与野生型患者相比，KCNJ5体细胞突变在女性中更常见(56.6%对33.3%，P=0.02)。其次，KCNJ5基因突变患者的腺瘤直径更大(15 mm对11 mm，P=0.021)、尿醛固酮水平更高(23.3 μg/24 h对16.6 μg/24 h，P=0.038)、醛固酮(ng/dL)/肾素[ng/(mL·h)]比值更高(102 对42，P=0.007)，提示醛固酮过度分泌与突变的腺瘤可能存在关联。同时，KCNJ5突变患者的血钾水平更低(2.6 mmol/L对2.9 mmol/L，P=0.022)[14]。严重的低钾血症是PA患者的典型表现之一，因此KCNJ5突变患者更倾向于就诊，从而接受PA的筛查。一项纳入13项研究、约1 636例APA患者的荟萃分析也显示，KCNJ5突变患者的血浆醛固酮水平更高、年龄更小、腺瘤更大，且突变多见于女性，亚洲人群长期高钠饮食可能促进KCNJ5突变的发生[13]。但是，关于KCNJ5基因突变的研究中，仍缺乏APA患者饮食习惯的数据。另外，KCNJ5突变与手术预后的关系仍不明确[24-25]，需要长期随访研究,进一步明确。

与KCNJ5突变型和野生型相比，ATP1A1和ATP2B3突变的APA患者多见于男性，且血浆醛固酮水平更高，低钾血症更严重[19]。而CACNA1D突变的腺瘤直径(9 mm)显著小于KCNJ5突变型(16 mm)和野生型(12 mm)[11]。因此，CACNA1D突变患者易被忽视，可能影响了APA患者中CACNA1D基因突变的检出率。

3功能学研究

生理状态下，醛固酮由ZG细胞分泌。以胆固醇作为原料，在一系列特异性酶类的参与下进行转换，最终醛固酮合成酶(CYP11B2)催化皮质酮转变为醛固酮。高钾血症和血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)等因素可刺激醛固酮的产生。在背景内向整流钾通道TASK等因素的作用下，ZG细胞由静息状态下转为超极化状态。Ang Ⅱ与其Ⅰ型受体的结合，可阻断这种漏电流及其它钾通道，引起细胞膜去极化、电压门控性钙通道激活和Ca2+内流。细胞外K+也可直接引起细胞膜去极化和Ca2+内流。同时，Ca2+内流可通过激活钙/钙调蛋白激酶信号通路等机制，引起醛固酮合成限速酶的表达[26]。另外，慢性Ca2+信号可刺激ZG细胞增殖。

KCNJ5既可单独形成同源四聚体，又可与KCNJ3形成活性更强的异源四聚体[27]。Choi等将野生型(WT)或突变型KCNJ5和KCNJ3共转染至293T细胞，发现KCNJ3/KCNJ5WT使细胞膜超极化，反转电位为(-65±2) mV，且电流可被钡离子(Ba2+)阻断，K+与Na+通透比约为(25.3±4.4)∶1。相反，KCNJ3/KCNJ5Gly151Arg和KCNJ3/KCNJ5Leu168Arg均可使细胞膜去极化，反转电位分别为(0±2)mV和(-5±1) mV，且电流不能被Ba2+阻断，K+与Na+通透比下降至(1.0±0.1)∶1和(1.3±0.1)∶1。K+通道的GlyTyrGly序列构成一个狭窄孔道，可特异性允许K+进入细胞。Gly151是GlyTyrGly序列的第1个甘氨酸。Leu168位于第2个跨膜区域，侧链毗邻GlyTyrGly序列的酪氨酸侧链。选择性滤器附近的其他体细胞突变(delIle157[28]、insThr149[29]和Thr148-Thr149insArg[14])也表现出类似的电生理学特征，不过远离选择性滤器的Trp126Arg突变可间接影响选择性滤器附近的氨基酸和K+通道选择性[30]。体外实验也证实，KCNJ5基因体细胞突变可促进CYP11B2基因mRNA表达上调[14,29-30]。总之，KCNJ5突变体可能引起K+通道的选择性丧失，导致Na+内流，细胞膜去极化，Ca2+通过电压门控性钙通道和Na+/Ca2+交换进入细胞，醛固酮合成增加[8,29]。

进一步研究发现，G蛋白偶联钾通道阻断剂tertiapin-Q可阻断野生型通道的大部分K+电流，而对于突变通道的电流阻断效果明显降低。KCNJ5突变体改变了孔道结构形态，影响tertiapin-Q与离子通道的结合，这可能是引起Na+通透性异常的普遍机制[28]。L型钙通道阻断剂维拉帕米可抑制突变体部分Na+内流，Na+/Ca2+交换体阻断剂KB-R7943可完全阻断Na+内流[29]。这些药物是否可抑制醛固酮的自主分泌仍需进一步体外实验证实。

目前，尚无体外实验研究支持KCNJ5突变可引起细胞增殖，并且细胞内Ca2+超载通常引起细胞凋亡。一项关于视锥蛋白样蛋白1(VSNL1)的研究可能有助于解释为何KCNJ5基因突变患者的腺瘤直径更大。VSNL1是一种神经元钙感受器蛋白，参与钙信号的转导。与野生型腺瘤比较，KCNJ5突变型腺瘤的VSNL1表达增加，可能抑制细胞内Ca2+超负荷引起的细胞凋亡[31]。另外，也有研究发现，大部分APA患者中Wnt/β-catenin信号通路异常激活，Wnt抑制剂SFRP2可下调部分患者的Wnt信号，并且抑制APA的形成[32]。该信号通路在APA形成中的作用，及是否与KCNJ5突变存在关联，仍需更深入的研究。

ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D突变效应与KCNJ5基因突变类似，影响醛固酮的产生。ATP1A1基因的Leu104位于跨膜α螺旋的M1区，Val332(可能影响Glu334定位)位于M4区，同时Glu334和Leu104的相互作用可能影响K+与Na+/K+-ATP酶的结合和门控[19,33-34]。ATP1A1突变可显著降低ATP酶的活性，增加细胞内Ca2+浓度[19]。ATP2B3基因突变Leu425-Val426del和Val426-Val427del通过影响跨膜α螺旋M4的谷氨酸(对应于ATP1A1基因的Glu334)，改变Ca2+结合位点的空间结构[19]。ATP酶突变能引起细胞膜显著去极化，激活电压门控性钙通道[19]，促进CYP11B2和NR4A2的表达[30]。另外，CACNA1D基因体细胞突变可引起细胞膜电位负值增加，抑制通道失活或增加Ca2+电流，从而激活细胞内Ca2+信号通路和刺激醛固酮产生[20]。有研究发现，作为一种临床常用的L型钙通道阻滞剂，氨氯地平可能降低血浆醛固酮水平，影响部分PA患者的诊断[35]。这间接提示调控Ca2+稳态的相关基因突变可能影响醛固酮的产生。

4结语

KCNJ5、ATP1A1、ATP2B3和CACNA1D基因体细胞突变通过影响不同的离子稳态，增加细胞内Ca2+浓度，从而刺激ZG细胞分泌过多的醛固酮[36]。Dekkers等[37]研究发现，ATP1A1和CACNA1D基因突变可同时发生于同一多结节肾上腺内，不同结节也可发生KCNJ5基因的不同突变。推测这些突变的发生晚于肾上腺结节的形成，两个过程并无直接因果关系。然而，APA患者的这些突变是何时发生以及如何发生的，仍需进一步探索。目前关于APA体细胞突变的研究局限于已切除的腺瘤，探索无创性检测手段以在术前确定突变状态，将为APA的靶向治疗提供理论基础。

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(收稿：2015-08-11修回：2015-12-07)

(本文编辑：梁英超)

doi:10.3969/j.issn.1673-6583.2016.01.012

基金项目：国家自然科学基金青年项目(81500324)

通信作者：高平进，Email：gaopingjin@sibs.ac.cn