增生性瘢痕模型实验及机制分析*

高楚石，农晓琳

(广西医科大学口腔医学院口腔颌面外科，广西 南宁 530021)



增生性瘢痕模型实验及机制分析*

高楚石，农晓琳**

(广西医科大学口腔医学院口腔颌面外科，广西 南宁 530021)

摘要：目的 建立猪背增生性瘢痕模型，验证瘢痕中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。方法 在2头幼猪背部两侧制作非全厚皮损共24块，观察愈合过程并在术后30d取组织标本，行HE染色并采用免疫组化方法进行α-SMA染色并分析。结果 创伤4周内完成再上皮化，HE染色显示胶原纤维增生，排列紊乱，免疫组化检测发现瘢痕组织中α-SMA表达水平明显高于正常组织(P<0.05)。结论 α-SMA的持续表达可引起瘢痕挛缩，产生增生性瘢痕。

关键词：增生性瘢痕；瘢痕模型；α-SMA

增生性瘢痕在临床中十分常见，可导致患者外貌的损害、畸形及功能障碍等，对患者的生理和心理造成不利的影响。对增生性瘢痕的形成机制和治疗方法的相关研究一直进展较缓慢，迫切需要加强相关研究工作。通过构建合适的动物模型是开展增生性瘢痕基础研究与应用研究工作的一个重要实验方法。已有研究发现，猪的皮肤与人的皮肤结构相近，对创伤的反应也与人体的类似，主要是通过再上皮化机制修复创伤[1～4]。在人类皮肤创面的愈合过程中，肌成纤维细胞扮演着重要的修复角色[5]，在正常组织中，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)只在血管平滑肌细胞和肌肉组织中出现，但在病理情况下，其出现则较广泛[6]。Betz等[7]观察到，伤后在肌成纤维细胞中α-SMA有较强的阳性，损伤后，创伤修复是一个有序的调节过程，包括肌成纤维细胞的激活与增殖，表达α-SMA的肌成纤维细胞与瘢痕挛缩和细胞外基质的产生相关。本文通过对幼龄白猪皮肤致伤并使其再上皮化后形成增生性瘢痕，取瘢痕组织进行病理观察，进一步探讨其瘢痕与人类增生性瘢痕的相似性，为进一步研究创伤愈合及瘢痕形成机制及其治疗方法打下一定基础。

1材料和方法

1.1实验对象普通白猪2头，4月龄，雌性，体质量为(12±0.3)kg。

1.2主要试剂S-P试剂盒，抗α-SMA抗体(中杉金桥公司)，DAB显色试剂盒(博士德公司)。

1.3实验方法

1.3.1模型制备幼猪2头，术前12h禁食，8h禁水。用Ⅱ型速眠新(0.2ml/kg)肌注，待动物四肢无力后用3%戊巴比妥钠(0.3ml/kg)肌注。实验动物取俯卧位，背部去毛、局部络合碘消毒，手术制造非全厚皮肤缺损，猪背两侧分别建立创面6块，面积均为3cm×3cm。术后分圈饲养，待其自然表皮化愈合。

1.3.2标本固定处理手术后30d取瘢痕组织，10%甲醛固定，包埋，备用。

1.3.3常规HE染色石蜡切片脱蜡复水，水洗后苏木精染色5min~10min，冲洗后分化、返蓝，伊红染色5~10min，水洗、酒精梯度脱水、透明、封片。

1.3.4免疫组织化学染色石蜡切片脱蜡复水，3%过氧化氢孵育5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡，间接法抗原修复，采用SP方法进行免疫组织化学染色，DAB显色，再行苏木精复染，脱水，透明，封片，光学显微镜观察结果。

1.4观察指标肉眼观察猪背创面愈合及瘢痕形成情况。光学显微镜进行猪正常皮肤和愈后组织HE染色组织学观察。正常皮肤组织及瘢痕组织中α-SMA的表达情况，用Image-ProPlus图像分析系统以同一模式计算表达的光密度值作为其表达强度，并进行分析。

1.5统计与分析用 SPSS 16.0统计软件分析，数据结果以均数±标准差表示，用t检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1创伤愈合过程的肉眼观察创伤在1周后充满炎性肉芽组织，2周左右完全结痂，4周左右完成再上皮化，创面收缩；愈合后的皮肤挛缩、增厚，质地坚硬，无毛发生长，局部色素加深。创面愈合后高出周围正常皮肤，但与人类的增生性瘢痕相比显得较为平缓。

2.2正常皮肤与创伤后瘢痕组织标本的HE染色正常皮肤包括表皮、真皮及皮下组织，真皮由胶原纤维、基质及成纤维细胞等组成，真皮乳头结构明显，胶原纤维呈互相平行较有规律的束状排列，见图1(封二)。而创伤愈合后的瘢痕组织真皮内胶原纤维大量增生，呈漩涡状或结节状分布，有数量不等的成纤维细胞和小血管，各胶原小结节之间由粗大的胶原纤维束将其分隔，见图2(封二)。

2.3正常皮肤与瘢痕组织中α-SMA的表达情况正常皮肤中，α-SMA抗体阳性可在小血管周围的平滑肌细胞中观察到，见图3(封二)。瘢痕组织中，真皮组织的肌成纤维细胞和新生的小血管均有阳性反应(黄色或棕黄色)细胞，见图4(封二)。统计结果表明，正常皮肤组织切片α-SMA表达水平(0.0497±0.0624)与瘢痕组织切片α-SMA表达水平(0.1385±0.0404)有显著性差异(P<0.05)。

3讨论

增生性瘢痕的形成机制目前尚未完全探讨清楚，一般认为其形成是以成纤维细胞为主的细胞增殖，以胶原纤维为主的细胞外基质大量沉积，可产生挛缩从而出现增生性瘢痕。α-SMA是血管平滑肌结构特有的肌动蛋白，是平滑肌细胞收缩的结构基础，也是成纤维细胞收缩表型的典型标志。瘢痕挛缩是一个非常复杂的病理过程，目前己有研究证实，细胞骨架与细胞收缩有关，而肌动蛋白是细胞骨架中微丝的主要结构成分，瘢痕挛缩与细胞骨架主要成分的α-SMA密切相关[8]。

以往对于增生性瘢痕的研究主要通过以下途径：一是将人的瘢痕组织移植到裸鼠背部皮下，但植入的瘢痕组织只可维持60d左右；二是通过在兔耳腹面做深及软骨的皮肤创面，可产生突出于皮肤表面的增生性瘢痕，便于对瘢痕形成的过程进行观察研究，但其与人类伤及真皮层即可产生瘢痕不同；三是将人类的瘢痕组织进行细胞培养，以便研究瘢痕特性，但无法获知创伤愈合的过程。由于缺乏动物自身产生的与人类相近的可靠增生性瘢痕动物模型，从而限制了其病因及治疗方法的实验研究。由于微型猪的皮肤结构、免疫组化反应特性，甚至表皮细胞的更新时间都和人体皮肤非常接近[9]，近年来国内外学者均证实雌性杜洛克猪在创伤后可产生增生性瘢痕，且与人类的增生性瘢痕较为相似，只是较之人类增生性瘢痕较为平坦，且色素沉着较少[10]。

本研究以常见幼龄白猪为实验动物，致伤建模后初步观察创面愈合后的瘢痕形态、瘢痕形态、组织学特点，并用免疫组织化学的方法观察瘢痕组织内α-SMA的表达，发现与人类具有一定相似性，α-SMA的表达可引起瘢痕挛缩，产生增生性瘢痕。但该实验的实验动物非近交系，且样本量偏少，动物个体差异有可能造成偏差。今后将寻找更合适作瘢痕模型的近交系猪种，保证个体差异小，从而建立更为经济、可靠的增生性瘢痕模型，并在此基础上进一步研究创伤愈合及瘢痕形成的机制及治疗方法。

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[10]Singer AJ,McClain SA,Hacht G,et al.Semapimod reduces the depth of injury resulting in enhanced re-epithelialization of partial-thickness burns in swine[J].J Burn Care Res,2006,27(1):40

Experimental Study and Its Mechanism Analysis of Hypertrophic

GAO Chu-shi，NONG Xiao-lin

(DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,CollageofStomatology,Guangxi

MedicalUniversity，NanningGuangxi530021,China)

ABSTRACT：Objective To establish a porcine model of hypertrophic scar and to verify the expression of α-SMA in scars. Methods 24 pieces of non full-thickness skin lesions were made on the back of 2 young pigs.Then the healing process was observed. The tissue samples were selected for HE staining 56 days after operation.The expression of α-SMA was analysed by immuno histochemistry.Results The re-epithelializing time was less than 4 weeks.The collagen appeared irregular proliferation after HE staining.The α-SMA expression of scar tissues was obviously higher than that in normal tissues with statistically significance (P<0.05).Conclusion The continuous expression of α-SMA can lead to contracture of scars ,and produce hypertrophic scars.

KEY WORDS：Hypertrophic scar;Scar model;α-SMA

(收稿日期：2015-10-13)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.01.0005

中图分类号：R751.05

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2016)01-0005-03

*基金项目：广西科学研究与技术开发计划课题(2014ED37035)

**通讯作者，E-mail:labnong@hotmail.com