巴戟天水提取物对间充质干细胞成骨分化中OPG/RANKL表达的影响

吴国志，欧积壮，吴昌新

(海南省农垦总医院骨二科，海南 海口 570311)

·论 著·

巴戟天水提取物对间充质干细胞成骨分化中OPG/RANKL表达的影响

吴国志，欧积壮，吴昌新

(海南省农垦总医院骨二科，海南 海口 570311)

目的 在成骨诱导条件下，探讨巴戟天水提取物对骨髓间充质干细胞(MSCs)中骨保护素(OPG)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)表达的影响。方法取原代大鼠MSCs，行碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色，确定其成骨分化能力；使用0(对照组)、10 g/L(M1组)及100 g/L(M2组)浓度的巴戟天水提取物处理MSCs细胞，在成骨诱导的条件下干预7 d，收集细胞培养液，并提取细胞的总RNA及总蛋白，采用ELISA法检测培养液中OPG/RANKL的分泌水平，采用Real-time PCR及Western Blot检测MSCs的OPG/RANKL基因和蛋白表达水平。结果经ALP和茜素红染色可见MSCs着色明显。M1处理组和M2处理组OPG/RANKL基因表达水平较对照组上升，分别为(29.0±6.3)%和(60.0±5.4)%；同时M1及M2组细胞培养液中OPG/RANKL的蛋白分泌水平分别较对照组上升(17.0±4.1)%和(39.0±6.4)%；通过Western Blot检测，M1组及M2组OPG/RANKL的蛋白表达较对照组上升(20.0±4.3)%和(35.0±4.3)%。以上结果经统计学分析，其差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论巴戟天水提取物可以提升MSCs细胞分泌的OPG/RANKL水平，改善骨质疏松患者OPG/RANKL比例失衡状况，这是巴戟天抗骨质疏松的主要机制。

巴戟天；水提取物；间充质干细胞；骨保护素；核因子κB受体活化因子配体；骨质疏松

原发性骨质疏松症(OP)是以骨量减少、骨的微观结构退化、骨的脆性增加以及容易发生骨折为特征的一种全身性骨骼疾病，多发生于65岁老年人以及绝经后的妇女[1-2]。我国是世界上拥有OP患者最多的国家，约有9 000万患者，占总人口的7%。骨质疏松症患者更容易发生股骨颈骨折、肱骨近端骨折及脊柱压缩性骨折，骨折给患者带来痛苦和困扰，并带来巨大社会经济负担[3]。在骨代谢的过程中，正常的骨重建是破骨细胞和成骨细胞两种细胞在骨代谢中达到旧骨吸收与新骨形成之间的动态平衡的过程，这种平衡被打破是骨质疏松症发生的重要原因。近来的研究发现OPG/RANKL细胞因子系统在骨重建过程中发挥着至关重要的作用[4]。前期有学者研究发现：巴戟天醇提取物对原发性骨质疏松症有明显的防治作用，然而巴戟天水提取物的作用以及对OPG/RANKL系统的影响尚不明确。本研究旨在通过实验手段，探讨巴戟天水提取物促进间充质干细胞的成骨分化的具体机制是否与OPG/RANKL系统有关。

1 材料与方法

1.1 主要的试剂和仪器 巴戟天水提取物(西安润泽生物科技公司，中国)；F12-DMEM培养基(Hyclone，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；Trizol试剂盒，逆转录试剂盒(Invitrogen，美国)；碱性磷酸酶染色试剂盒(碧云天，中国)；成骨诱导培养基、茜素红染液(Cyagen，中国)；SYBRGreen染料(Fermentas，美国)；胰蛋白酶、OPG及RANKL Elisa试剂盒(博士德，中国)；兔抗OPG、RANKL多克隆抗体(Abcam，美国)；5%二氧化碳培养箱(ThermoForma，美国)；台式水平离心机(Heal Force，中国)；实时定量聚合酶链式反应仪(BIO-RAD，美国)。

1.2 实验动物 8周龄雄性SD大鼠30只，由海南医学院实验动物中心提供。

1.3 大鼠间充质细胞(MSCs)的分离和培养 取8周龄SD大鼠，脱颈处死后使用75%酒精浸泡20 min，取出股骨并去除周围软组织，使用充满F12-DMEM培养基(含10%胎牛血清)的10 ml注射器冲洗骨髓至骨髓发白，吹打成细胞悬液，1 500 r/min，离心半径6 cm，离心5 min，收集有核细胞，调整细胞浓度至5×105/ml，接种于细胞培养瓶，并置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。每2～3 d换液一次，当细胞生长至铺满瓶底70%～80%时，使用0.25%的胰酶消化，按照1∶3的比例进行传代，取第3代细胞进行实验。

1.4 MSCs成骨分化的鉴定 使用第三代的细胞，0.25%的胰酶消化后，细胞计数，调整细胞密度至5×105/ml，接种至24孔板培养，使用成骨诱导培养基培养7 d和28 d。分别行ALP染色和茜素红染色。ALP染色方法按照碧云天ALP染色试剂盒所述方法实施，茜素红染色使用Cyagen成骨诱导培养基附赠之茜素红染液，按照Cyagen的染色说明进行染色。

1.5 实验分组及处理 按照5×105/ml的密度，接种MSCs于6孔板，待细胞长满后，分为三组：0 g/L巴戟天水提取物(空白对照组，C组)，10 g/L巴戟天水提取物(M1组)，100 g/L巴戟天水提取物(M2组)，干预7 d，收集细胞及细胞培养基。

1.6 荧光定量PCR检测基因的表达 使用Trizol试剂提取各组细胞的总RNA：每孔加1 ml Trizol进行裂解，随后加入200 μl氯仿，剧烈混匀，12 000×g离心15 min；吸取上层水相400 μl，加入等体积异丙醇，12 000×g离心10 min，弃上清；使用75%乙醇7 500×g离心5 min进行洗涤，然后加入50 μl DEPC水。按照Invitrogen说明书的方法将总RNA逆转录形成cDNA，使用用美国BIO-RAD公司实时定量PCR仪进行PCR扩增，检测OPG及RANKL的基因表达；PCR反应体系(20µl)，反应条件：95℃，3 min变性；95℃，30 s，62℃，40 s，共40个循环。读取各基因的Ct值，采用2-△△CT方法进行相对定量分析。实验结果均重复3次。

1.7 ELISA法检测细胞上清中蛋白的表达 按照博士德OPG及RANKL ELISA试剂盒的说明，检测细胞培养上清中OPG及RANKL的蛋白浓度，每个样本设三个复孔。

1.8 总蛋白提取及Western Blot检测 收获细胞，提取总蛋白(参照博士德蛋白抽提试剂盒)。按照1∶4比例加入上样缓冲液，混匀后置于100℃水浴5 min，使蛋白变性。上样蛋白量为20 μg，使用垂直电泳进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜，使用5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入一抗并4℃过夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温放置1 h，TBST再洗涤3次，使用谷歌生物公司ECL显影液进行显影，暗室内曝光。

1.9 统计学方法 应用SPSS13统计软件进行数据分析，所有计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，多组间比较采用one-way ANOVO中的Dunnet t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 间充质干细胞的成骨分化鉴定 碱性磷酸酶和钙结节分别为成骨分化的早期和晚期指标，可分别使用ALP和茜素红染色鉴定。如图1所示，ALP染色主要着色在细胞膜，呈紫色；茜素红染色主要在钙沉积部位呈红色。

图1 MSC成骨诱导7 d后ALP染色和茜素红染色结果

2.2 基因表达的测定 荧光定量PCR检测各实验组OPG和RANKL mRNA的表达，如图2所示，M1组及M2组OPG和RANKL基因表达水平经计算后以OPG/RANKL的形式与对照组进行比较，分别较对照组上升(29.0±6.3)%和(60.0±5.4)%，差异均有统计学意义(P＜0.05)。这样的结果表明巴戟天的水提取物可以促进成骨细胞OPG mRNA的表达和抑制RANKL的表达，并呈现一定的浓度依赖性。

图2 MSC成骨诱导7 d OPG和RANKL基因的表达

2.3 蛋白水平的测定 ELISA法检测细胞上清中分泌蛋白的表达，计算M1组、M2组及对照组细胞培养的上清中OPG、RANKL水平，OPG/RANKL的比值对照组为(1.01±0.02)，M1组为(1.17±0.06)，M2组为(1.39±0.08)。M1组和M2组分别较对照组上升(17.0±4.1)%和(39.0±6.4)%。Western Blot结果如图3所示，可见GAPDH、OPG和RANKL的蛋白条带，利用Image proplus进行灰度分析，所得的灰度值与GAPDH进行标准化后再计算OPG/RANKL的比值，M1组和M2组分别与对照组比较，OPG/RANKL蛋白水平分别上升了(20.0±4.3)%和(35.0±4.3)%。

图3 MSC成骨诱导7 d OPG和RANKL蛋白的表达

3 讨 论

已有文献报道，巴戟天的提取物和含药血清均能促进成骨细胞的增殖、分泌ALP与骨钙素、增加成骨细胞的矿化，其中巴戟天水提取物可促进转化生长因子β1mRNA的表达[5-6]，但巴戟天对骨髓间充质干细胞的作用却报道较少。本研究表明，巴戟天水提取物能影响MSCs细胞分泌OPG/RANKL的水平，从基因水平和蛋白水平都得到很好的验证。巴戟天水提取物能促使MSCs分泌OPG升高，RANKL相对下降，OPG/ RANKL比值增高。这些结果表明巴戟天水提取物能改善骨质疏松患者OPG/RANKL比例失衡状况，OC的数量和活性降低，从而改变骨质疏松的发展，减少老年患者骨质疏松性骨折发生的概率。

骨髓间充质干细胞在体外可表现为多向分化潜能，特别是在成骨分化中得到了广泛的应用。MSCs的成骨和成脂分化能力失衡也成为骨质疏松的一个重要原因，最近的研究表明MSCs还通过直接接触和旁分泌的形式影响破骨细胞的分化和功能，从而改变骨代谢[7]。OPG/RANKL是近年来研究发现的骨代谢重要通路之一，OPG/RANKL均可由MSCs分泌。许多细胞因子、激素等均直接或间接影响成骨细胞(OB)、破骨细胞(OC)的成熟、分化。RANKL是TNF超家族成员之一，主要由成骨细胞及间充质干细胞分泌，RANKL可与破骨前体细胞膜受体RANK结合，刺激破骨前体细胞分化并可以使成熟的破骨细胞活化，增强其骨吸收能力[8]。骨保护素(OPG)属于TNF受体超家族。OPG与膜受体RANK竞争性结合RANKL，阻断RANKL与破骨细胞系细胞表面的RANK结合，从而抑制骨吸收[9]。OPG/RANKL比率的改变可以直接影响破骨细胞的发育，当比率上升时OC的数量和活性降低。总之，正常的骨重建和骨量的稳定依赖于OPG和RANKL的平衡。

原发性骨质疏松分为绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松，绝经后骨质疏松患者主要是由于绝经后雌激素分泌减少，Eghbali-Fatourechi等[10]发现，绝经后妇女体内骨髓基质细胞RANKL表达增高，且与雌激素水平呈负相关，雌激素缺乏时，抗骨吸收的因子如TGF-β合成减少，引起OPG基因表达下降；老年性骨质疏松患者，随着年龄的增加存活的成骨细胞逐渐减少以及ROS系统激活导致成骨细胞核骨髓基质细胞分泌的RANKL增加、OPG表达下降。这些均造成OPG/RANKL比例失衡，成为原发性骨质疏松的主要机制[11-13]。

同时本研究也有一些局限性。巴戟天水提取物激动后细胞内相关的信号通路的变化我们并没有关注，间充质干细胞对破骨细胞的直接影响未得到验证。但由于OPG/RANKL系统在骨质疏松中的重要作用，我们的研究也有着一定骨科基础和临床意义。

综上所述，我们能得出这样的结论，巴戟天水提取物通过增加MSCs细胞分泌的OPG/RANKL水平来间接影响骨髓微环境中破骨细胞的生成，改善骨质疏松患者OPG/RANKL比例失衡状况，从而达到治疗原发骨质疏松的目的。

[1]Neuerburg C,Stumpf U,Mutschler W.Osteoporosis[J].Unfallchirurg, 2015,118(11)∶904

[2]Raisz LG.Pathogenesis of osteoporosis∶concepts,conflicts,and prospects[J].J Clin Invest,2005,115(12)∶3318-3325.

[3]Lems WF.Fracture risk estimation may facilitate the treatment gap in osteoporosis[J].Ann Rheum Dis,2015,74(11)∶1943-1945.

[4]Martin TJ,Sims NA.RANKL/OPG;Critical role in bone physiology [J].Rev Endocr Metab Disord,2015,16(2)∶131-139.

[5]王和鸣,王力,李楠.巴戟天对骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程Cbfα1表达的影响[J].中国中医骨伤科杂志,2004,12(06)∶24-28,31.

[6]李楠,王和鸣,郭素华,等.巴戟天多糖对体外培养成骨细胞核心结合因子α1mRNA表达的影响[J].中华中医药杂志,2007,22(8)∶517-519.

[7]Deans R.Towards the creation of a standard MSC line as a calibration tool[J].Cytotherapy,2015,17(9)∶1167-1168.

[8]Pichler K,Loreto C,Leonardi R,et al.RANKL is downregulated in bone cells by physical activity(treadmill and vibration stimulation training)in rat with glucocorticoid-induced osteoporosis[J].Histol Histopathol,2013,28(9)∶1185-1196.

[9]Gurban CV,Mederle O.The OPG/RANKL system and zinc ions are promoters of bone remodeling by osteoblast proliferation in postmenopausal osteoporosis[J].Rom J Morphol Embryol,2011,52(3 Suppl)∶1113-1119.

[10]Eghbali-Fatourechi G,Khosla S,Sanyal A,et al.Role of RANK ligand in mediating increased bone resorption in early postmenopausalwomen[J].J Clin Invest,2003,111(8)∶1221-1230.

[11]李运海,王亚非,尉志强,等.巴戟天对骨代谢相关作用的实验研究进展[J].中国医药科学,2013,3(22)∶27-29,75.

[12]郑素玉,陈健,何剑全,等.巴戟天含药血清对成骨-破骨细胞共育体系CAⅡ、NFAT2mRNA表达的影响[J].中国骨质疏松杂志, 2013,19(2)∶120-124,134.

[13]黄慧,陈健,何剑全,等.巴戟天含药血清对成骨-破骨细胞共育体系OPGmRNA、RANKLmRNA表达的影响[J].中国骨质疏松杂志,2015,21(1)∶67-71.

Effect of Morinda Root aqueous extract on the expression of OPG/RANKL in mesenchymal stem cells.

WU Guo-zhi,OU Ji-zhuang,WU Chang-xin.Department of Orthopedics,Hainan Provincial Nongken General Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of Morinda Root aqueous extract on the expression of osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor Kappa B ligand(OPG/RANKL)in mesenchymal stem cells(MSCs)under osteogenic induction.MethodsThe primary cultured rat MSCs was stained by alkaline phosphatase(ALP)and alizarin red to identify the osteogenic differentiation ability.MSCs were cultured in the medium containing 0(control group),10 g/L(M1 group)and 100 g/L(M2 group)Morinda Root aqueous extract for seven days.Culture supernatant and cells were collected,and total RNA and total protein were extracted.The secretion level of OPG/RANKL was detected by using ELISA,and the expression levels of OPG/RANKL gene and protein were detected by Real-time PCR and Western Blot.ResultsMSCs were stained after treatment with ALP and alizarin red.Compared with the control group, the mRNA expression of OPG/RANKL in M1 group and M2 group were increased by(29.0±6.3)%and(60.0±5.4)%, and the secretion level of OPG/RANKL protein in cell culture fluid were increased by(17.0±4.1)%and(39.0±6.4)%. Western Blot showed the protein expression of OPG/RANKL were increased by(20.0±4.3)%and(35.0±4.3)%.These differences were all statistically significant(P＜0.05).ConclusionMorinda Root aqueous extract can up-regulate the expression of OPG/RANKL in MSCs,and improve the imbalance of RANKL/OPG in patients with osteoporosis,which is the main mechanism of Morinda officinalis in treatment of osteoporosis.

Morinda Root;Aqueous extract;Mesenchymal stem cells(MSCs);Osteoprotegerin(OPG);Receptor activator of nuclear factor Kappa B ligand(RANKL);Osteoporosis

R-332

A

1003—6350（2016）03—0345—04

2015-10-18)

海南省卫计委普通科研项目(编号：14A200077)

吴国志。E-mail：wuguozhi0898@163.com