Toll样受体-4在不同人群膝关节液中的表达及其与骨性关节炎病情的关系*

陈　奇，　吴　巍，　徐小峰△，　汤　汇，　曹学书

1江苏大学附属医院骨科，镇江　2120012华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉　4300303江苏省镇江市黎明社区卫生服务中心检验科，镇江　212031



Toll样受体-4在不同人群膝关节液中的表达及其与骨性关节炎病情的关系*

陈奇1，吴巍2，徐小峰1△，汤汇3，曹学书1

1江苏大学附属医院骨科，镇江2120012华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉4300303江苏省镇江市黎明社区卫生服务中心检验科，镇江212031

摘要：目的探索Toll样受体-4(Toll-like receptor-4，TLR-4)在不同人群膝关节液中的表达及其与骨性关节炎(osteoarthritis，OA)病情严重程度之间的关系。方法招募符合标准的受试者，分别纳入正常组、创伤组、轻度OA组、重度OA组，另设阴性对照组和阳性对照组，抽取各组受试者关节液，以ELISA法检测TLR-4，酶标仪读取A值，以t检验比较各组间A值的差异。结果正常组TLR-4水平和阴性对照组相当(t=1.284，P=0.210)，创伤组TLR-4表达较正常组明显增高(t=74.019，P=0.000)，位于5～10 ng/mL之间。无论是轻度OA还是重度OA，TLR-4水平均高于正常组(轻度vs.正常：t=169.173，P=0.000；重度vs.正常：t=927.885，P=0.000)，但两组间比较，重度OA组TLR-4水平高于轻度OA组(t=178.186，P=0.000)，前者位于5～10 ng/mL之间，后者小于5 ng/mL。结论TLR-4在正常人群膝关节液中无明显表达，在创伤性急性应激患者膝关节液中表达明显增高。在OA患者膝关节液的TLR-4表达高于正常人群，且与OA病情严重程度相关。

关键词：Toll样受体-4；关节积液；创伤应激；骨性关节炎

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是细胞表面一种重要的模式调节受体(pattern recognition receptors，PRRs)，其结构上属于Ⅰ型跨膜糖蛋白，分为胞外域、跨膜域和胞内域，胞外域主要行使识别配体并与之结合形成配体-受体复合物的功能。胞内域与白细胞介素1受体(interleukin-1 receptor，IL-1R)家族成员胞浆区高度同源，称为Toll-IL-1受体结构域(Toll-IL-1 receptor domain，TIR)，藉此来募集下游含有TIR的信号分子，组成信号复合体，传递信息，调节机体功能。TLR发现最早、最重要的功能是对免疫反应的调控，包括启动初始免疫以及通过不同的亚型介导不同的炎性环境[1]，因而与许多炎性疾病的发生密切相关。膝关节是全身最复杂、最重要的负重关节，在压力负荷、创伤、代谢异常等因素的作用下，微环境发生着动态改变，了解TLR在膝关节液中的表达，能够帮助我们更加深入地理解膝关节病变的病理过程，指导临床诊治。本实验拟研究经典的TLR亚型——TLR-4在正常膝关节液、创伤性膝关节积液/积血、以骨性关节炎(osteoarthritis，OA)为代表的慢性退变性疾病膝关节积液中的表达，以探索其中的规律。

1材料与方法

1.1实验对象及分组

按如下标准选择招募对象，所有研究对象按江苏大学临床伦理学规范要求履行告知义务并签署同意书。①正常组：选择正常人群，无膝关节外伤、感染性疾病、非感染性炎症(包括OA、类风湿性关节炎等)。②创伤组：选择新鲜闭合的膝关节周围骨折患者，既往无膝关节病变病史。③OA组：选择临床诊断为OA的患者，既往无膝关节周围骨折病史、无膝关节感染病史、无类风湿性关节炎等其他非感染性炎症病史。根据OA病情程度分为轻度和重度两个亚组，①轻度OA组：受累关节疼痛，口服止痛药能缓解，不影响行走，X线片显示骨赘形成，关节间隙无明显改变；②重度OA组：受累关节严重疼痛，口服止痛药无法缓解，影响行走，患者活动减少，X线片显示关节间隙狭窄，甚至内、外翻畸形。上述每组/亚组各招募受试者15人，排除凝血功能障碍、软骨代谢性疾病、局部肿瘤的患者，排除精神疾患及认知功能障碍的患者。

由于年龄与OA的发病具有相关性，因此，将年龄作为可能的混杂因素，对各组研究对象的年龄进行配比控制。各组研究对象平均年龄无统计学差异(F=0.001，P=0.999)。

1.2实验材料

人TLR-4检测ELISA试剂盒(Elabscience，中国)；4°C低温冰箱(科隆公司，中国)；恒温水浴箱(苏州凯尔特，中国)；高速离心机(Heal Force，中国)；酶标仪(Biotech，英国)。

1.3研究方法

以注射器抽取研究对象膝关节的关节液/积血2 mL作为样本，以样本稀释液稀释1倍后加入ELISA试剂盒的酶标板中，分别为正常组、创伤组、轻度OA组、重度OA组，此外设阴性对照(检测PBS)和阳性对照(检测标准样)，每个样品孔加样100 μL。覆膜，37℃孵育90 min。弃液体，甩干，每孔加入生物素化抗体100 μL，覆膜，37℃孵育60 min。弃液体，甩干，每孔加入洗板液350 μL洗板3次，每次1 min，拍干。每孔加入稀释的辣根过氧化物酶结合物100 μL，覆膜，37℃孵育30 min。弃液体，甩干，每孔加入洗板液350 μL洗板5次，每次1 min。每孔加入底物显色液90 μL，避光37℃孵育15 min，待显色后即可加入终止液，每孔50 μL。将酶标仪波长调到450 nm放入酶标板测吸光度(A)值。

1.4统计学分析

2结果

2.1正常组和创伤组膝关节液/积血TLR-4水平

正常组研究对象膝关节液中TLR-4的A值平均水平为(0.053±0.001)，与阴性对照组(0.051±0.001)比较，差异无统计学意义(t=1.284，P=0.210)，可以认为正常人群膝关节液中无明显TLR-4表达。正常人群膝关节中存在的少量关节液主要与营养和润滑作用有关，而无明显炎性反应。

与正常组研究对象相比，创伤组患者膝关节积血中TLR-4的A值明显增高(1.064±0.003)，差异具有统计学意义(t=74.019，P=0.000)，以标准样为对照，TLR-4水平位于5～10 ng/mL之间。新鲜关节周围骨折因应激会产生急性炎性反应，导致TLR-4增高。

2.2OA患者关节液TLR-4水平

在OA组，无论是轻度还是重度，关节液中TLR-4的A值均高于正常组[A轻度=(0.486±0.010)，A重度=(0.972±0.040)]，差异具有统计学意义(轻度t=169.173，P=0.000；重度t=927.885，P=0.000)，说明OA的发生与炎性反应有一定关联。其中重度组TLR-4的A值高于轻度OA组，差异有统计学意义(t=178.186，P=0.000)，以标准样为对照，轻度OA组关节液TLR-4水平小于5 ng/mL，重度OA组关节液TLR-4水平位于5～10 ng/mL之间。结果表明，随着OA病情的加重，关节液中TLR-4水平升高。

3讨论

TLR是炎症反应的重要调节受体，能够介导许多炎性相关性疾病的发生[2]，在病变组织中表达增高[3-4]，因此，能够在一定程度上反映炎性相关性疾病的发展程度。本研究发现，正常人群膝关节液中TLR-4无显著表达，而在创伤引起的急性炎性反应中，TLR-4表达却显著增高，不仅高于正常人群，也高于OA各组。这与TLR-4主要促进白介素(Interleukin，IL)-1、6，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等急性炎症因子的分泌从而介导急性炎性环境的功能相符合[1]。

在OA人群中，关节积液的TLR-4表达较正常人群也有显著增高，且随着病情的加重而逐渐增加。这说明，炎性反应是OA的发病机制之一[5-6]。研究发现，在OA的早期就可以观察滑膜的炎性改变[4]，包括单核细胞聚集和炎性因子分泌。压力负荷也与炎症机制相关，静态压力增高可导致蛋白聚糖的消耗、胶原网络的破坏，刺激IL-1、TNF-α等炎性介质分泌[7-8]，导致病变滑膜以及关节液中炎性介质增多[9-10]，进而通过NF-κB信号通路介导软骨细胞的降解和凋亡[11]。

TLR-4通过对炎性反应的调节参与了OA的发病机制，不仅在软骨损伤处表达明显增高[3]，而且介导滑膜炎的发生[12]。一方面，TLR-4能够通过抑制Wnt/β-catenin通路抑制成骨细胞矿化[13-14]，引起软骨下骨的病理改变[15]。另一方面，炎性因子和DAMP作为配体与滑膜细胞和软骨细胞所表达的TLR结合后，通过NF-κB通路和经典TLR下游机制——MyD88通路激活下游的炎性和分解代谢基因MMP-1、3、13[16-17]，从而诱导胶原酶的表达，激活软骨细胞的降解途径。此外，TLR-4还能够通过诱导细胞自噬，引起关节软骨细胞的坏死和修复抑制[18]。因此，关节液TLR-4的表达高低一定程度上反映了OA病理改变的强弱。这与本研究的观察结果相符，重度OA组患者与轻度OA患者相比，关节液TLR-4显著增多。

综上所述，TLR-4在正常人群膝关节液中无明显表达，在创伤性急性应激患者膝关节液中表达明显增高。在OA患者膝关节液的TLR-4表达高于正常人群，TLR-4可能通过对炎性反应的调节参与了OA的发病机制，随着OA病情的加重，膝关节液TLR-4表达逐渐增高。

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(2015-12-03收稿)

Expression of TLR-4 in Synovial Fluid of the Knee Joint in Different Populations and Its Association with Osteoarthritis

Chen Qi1，Wu Wei2，Xu Xiaofeng1△etal

1DepartmentofOrthopedics，AffiliatedHospitalofJiangsuUniversity，Zhenjiang212001，China2DepartmentofOrthopedics，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo examine the expression of Toll-like receptor-4(TLR-4) in synovial fluid of the knee joint in different populations，and the association of the TLR-4 expression with the severity of osteoarthritis(OA).MethodsSubjects who met the inclusion criteria were recruited and assigned into the normal group，the trauma group，the mild OA group，and the severe OA group，respectively.Negative control group and positive control group were also established.The TLR-4 levels were detected by ELISA in the knee joint synovial fluid harvested from subjects in each group.Absorbance(A)values were obtained on the microplate reader.The differences of A values between groups were compared by t test.ResultsThe TLR-4 levels in the normal group were similar to those in the negative control group(t=1.284，P=0.210).The trauma group had higher levels of TLR-4(5-10 ng/mL)than the normal group(t=74.019，P=0.000).The TLR-4 levels were significantly increased in both mild and severe OA groups as compared with the normal group(mild OA group vs.normal group：t=169.173，P=0.000；severe OA group vs.normal group：t=927.885，P=0.000).They were significantly higher in the severe OA group(5-10 ng/mL)than in the mild OA group(<5 ng/mL)(t=178.186，P=0.000).ConclusionTLR-4，barely expressed in the synovial fluid of the knee joint，is significantly increased in patients suffering trauma.Additionally，it is profoundly enhanced in the OA patients，which is also closely associated with the severity of the condition.

Key wordsToll-like receptor-4；synovial fluid；trauma；osteoarthritis

中图分类号：R684.3

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.018

*江苏大学博士创新基金(No.jdfyRC-2013017)

陈奇，男，1982年生，主治医师，讲师，医学博士，E-mail：jackiechanoth@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：13775534791@163.com