人工诱导葡萄多倍体鉴定研究进展

2016-03-08郭亚雷

河北果树 2016年3期

关键词：多倍体四倍体染色体

郭亚雷

（河北省武安市职教中心 056300）

人工诱导葡萄多倍体鉴定研究进展

郭亚雷

（河北省武安市职教中心 056300）

介绍葡萄多倍体人工获得的途径，阐述和总结葡萄多倍体鉴定方法，并对近几年探索的一些新方法做系统介绍。

葡萄；多倍体；倍性鉴定

多倍体植物在自然界中普遍存在。据调查，在果树中约有半数以上的树种含有多倍体类型或为多倍体[1]。例如：苹果、梨、葡萄等，都含有多倍体类型。果树多倍体类型与普通二倍体类型相比具有果实大，生长旺盛，产量高，抗逆性和适应性强，果实无籽或少籽的特点[2]，并且可以以嫁接等无性繁殖的方式使其优良性状得到稳定的延续[3]。鉴于这些优点，果树多倍体的选择与育种工作受到越来越多的关注，已成为育种工作者所青睐的对象。葡萄多倍体的选择为生产大粒葡萄和无核葡萄提供了广阔的空间，从而创造了巨大的科研和经济价值。

1 葡萄多倍体人工获得途径

伴随着鲜食葡萄需求的日益增长，多倍体葡萄以其早熟、果粒大、种子少或无深受市场和消费者的欢迎。葡萄多倍体的选育工作显得尤为重要[4]。

在多倍体育种中，常用的人工获得多倍体的途径有：物理诱变﹑化学诱变以及生物学途径[5，6]。在葡萄多倍体诱导中化学方法诱导是最常用的方法。其中的秋水仙素是至今发现的加倍效果最好、使用最广泛的染色体加倍剂。前人利用秋水仙素来处理种子[7，8]、芽[9]、茎段[10]、茎尖[11]等具有分生能力的组织和器官都获得了理想的结果。

此外，还可以通过生物学来获得葡萄多倍体。主要包括体细胞杂交法和2n配子有性多倍化。

但是，无论用哪种方法，植物组织在经过多倍化处理后，并不是所有材料的染色体都会加倍，这中间还会产生一些非整倍体和嵌合体。这样，如何准确将多倍体挑选出来就成为多倍体研究的重要环节。

2 葡萄多倍体鉴定方法

葡萄多倍体的鉴定方法遵从果树多倍体鉴定方法，有直接鉴定法和间接鉴定法[12]。但是，为了确保鉴定结果的准确性，一般采用两种方法相结合。

2.1 直接鉴定法直接鉴定法即染色体制片法，是进行细胞倍性鉴定最直接、最可靠的方法。直接鉴定法计数准确而且不需要复杂的实验仪器，是目前应用最多的鉴定方法。

对于采用间接方法初步断定为多倍体的材料，还应鉴定其染色体数目是否增多，从而为鉴定结果提供最直接的证据。对于葡萄来说，染色体计数法常采用根尖、幼嫩的卷须和嫩梢[13，14]进行压片。也有的在花期鉴定花粉粒来确定染色体的数目。

根尖是由组织发生层的LⅢ层衍生而来，因此其细胞内染色体数目变化可以反映 LⅢ层是否发生倍性变化。检查根尖细胞中的染色体数，不但能区别倍性，而且能鉴定出是整倍性或非整倍性的变异。

钱春在白香蕉葡萄芽变突变体鉴定及四倍体诱导研究中，首先采用根尖做试验材料进行初步鉴定，然后用植株萌发新梢长出的卷须进行连续鉴定，避免了有些只是根部加倍而地上部不加倍的现象，获得了理想的结果[5]。

染色体数目法要求材料是处于旺盛生长的部位或器官才可以并且需要在显微镜下数至少5个细胞，才能确认某一材料的倍性。要求试验人员具有较高的水平。对于染色体数目较少的材料还简单一点，可是对染色体数目比较多的材料则费时费力。

大概是因为有了些距离，爱情里的美好就显露出来了，他们都知道其实他们还爱着，所以在“分手”一个多月的时候，他们还是复合了。

该方法的步骤一般分为：取材→预处理→固定→解离→染色→镜检[1]。直接鉴定法根据不同材料各步骤略有不同，它包括常规压片法和去壁低渗法。刘文革等通过对诱导的西瓜和甜瓜植株的根尖细胞染色体直接计数进行四倍体的倍性鉴定[15]。常金华等运用去壁低渗法对人工诱变的四倍体玫瑰香葡萄卷须的染色体进行计数确定倍性[16]。

2.2 间接鉴定法

2.2.1 根据多倍体果树生物学特性进行鉴定根据植株器官如根、茎、叶、花、果实、种子的形态、颜色等在各倍性之间的差异来进行倍性识别。

一般情况下多倍体较之相应的二倍体植株根、茎变粗，叶片变大、加厚、叶色加深、叶形指数变小，花、果变大，种子形状大小改变，叶色及花色改变[14]等，在一些植物中可用来初步判断其倍性水平。

利用形态学鉴定倍性简单、直观、快速，无需仪器设备，实用性强，对熟悉该作物的人准确率也较高，工作量不大。不足之处是经验因素影响大，可能会因人而异，且部分材料需在植株生长发育较晚时期才能鉴定使育种材料不能得到充分利用。

2.2.2 根据解剖结构特征进行鉴定

2.2.2.1 根据叶解剖结构和超微结构特征进行鉴定由于染色体组成倍增加，多倍体在形态上一般表现出巨大性。细胞的巨大性是区别植物多倍体和二倍体的指标之一，此外也可根据叶片栅栏组织的厚薄等进行鉴定[16]。

2.2.2.2 根据气孔性状进行鉴定多倍体叶片气孔增大，气孔密度下降，保卫细胞内叶绿体数目增多，这些特征可用于倍性鉴定。戴洪义利用保卫细胞叶绿体数目和气孔长度，获得的鉴定倍性判别方程，用于倍性鉴定获得了较理想的结果[17]。

2.2.2.3 根据梢端组织发生层细胞特征进行鉴定芽变选种是无性繁殖植物育种的一种有效途径，多以嵌合体的形式存在，特别是多倍体芽变。通过检测梢端分生组织LⅠ、LⅡ、LⅢ三层细胞的细胞、细胞核及核仁的大小，可以鉴定芽变材料倍性嵌合体的类型。齐永顺在四倍体玫瑰香倍性鉴定中采用了检测分生组织LⅠ、LⅡ、LⅢ三层细胞的细胞、细胞核及核仁的大小获得了理想的结果[18]。气孔保卫细胞大小及其中的叶绿体数是由LⅠ层衍生而来。

2.2.2.4 根据花粉粒特征进行鉴定花粉粒是由组织发生层的LⅡ层衍生而来，不同倍性的花粉粒性状上也存在差异。一般认为，多倍体植株的花粉粒大、萌发孔多、花粉粒形状变化明显等。同时，多倍体花粉粒大小不均匀，此外因多倍体花粉母细胞减数分裂不正常，致使花粉畸形从而致使不育。三倍体多不育。

2.3 生理生化指标鉴定植物倍性的差异引起生理特性的改变，导致生理生化指标的相应改变，所以其生理生化指标也可作为鉴定植物倍性的依据。例如持水量、渗透压、呼吸作用、含糖量、维生素含量、矿物质含量、氨基酸含量、光合速率、蒸腾速率及同工酶、酶带变化等[19]。

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 多倍体果树同工酶电泳谱带的特征多倍体与二倍体的种种差异，根本的原因来自于基因的不同，比较多倍体与二倍体的基因组成及表达的特点，是反映多倍体本质的重要内容。一般认为，多倍体植株同工酶同一位点基因剂量加倍，控制该位点的酶的量相应增加，同工酶电泳谱带的深度因而增加，而二倍体的同工酶电泳谱带则没有类似的特征[20]。利用同工酶鉴定果树倍性的研究并不多，而且此法技术复杂，受酶的影响大[1]。为达到实用的目的，还需进一步研究。

2.4.2 流式细胞仪鉴定流式细胞仪也称倍性分析仪，是进行流式细胞分析的仪器。它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，可以定量地测定某一个细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量[21]。更特别是它可以将某一个特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来[22]。随着倍性的增加，DNA含量呈倍性增加趋势，据此可判断其倍性水平。

使用流式细胞仪分析时，一般将需要检测的细胞群体分散，对待测的成分进行特殊的染色，然后将悬液中的细胞以1个细胞/ms的速度(1 000万细胞/h)[22]一个个地通过流式细胞仪，这样检测器就可以测出并且记录每个细胞中的待测成分的含量，并根据要求将该成分含量不同的细胞分离出来。如果染色过程不影响细胞活性，那么分离出来的细胞还可继续培养[22]。

近年来，流式细胞仪用于植物细胞核DNA含量的研究陆续在世界各国开展起来，迄今已对玉米、向日葵、甘薯、木薯、猕猴桃与李进行过研究，这些研究表明，利用流式细胞光度术测定细胞核DNA含量可鉴定倍性。流式细胞仪的问世为植物染色体倍性的研究提供了一条便捷的途径，鉴定快速方便，且准确性较高[23]。