盐酸埃克替尼对人T淋巴细胞增殖的影响

韩贵良 石岩 任冠颖 王小磊

（河北大学附属医院肿瘤内科，河北保定071000）

盐酸埃克替尼对人T淋巴细胞增殖的影响

韩贵良 石岩 任冠颖 王小磊

（河北大学附属医院肿瘤内科，河北保定071000）

目的观察酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitor，TKI）盐酸埃克替尼对人T淋巴细胞增殖的影响。方法应用免疫磁珠分选的方法从外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中分选出T淋巴细胞，分别加入不同浓度的盐酸埃克替尼培养1 h后，加入PMA刺激T细胞增殖，培养48～72 h后分别收集细胞和细胞培养上清。采用四氮甲唑兰比色法（MTT法）检测各组细胞的增殖情况。结果本研究比较了培养72 h后各组细胞的增殖情况，发现盐酸埃克替尼能够抑制T细胞的增殖，各组抑制率如下：盐酸埃克替尼1000 ng/mL组为（12.0±5.0）%（P=0.053），2500 ng/mL组为20.0±3.6%（P=0.011），5000 ng/mL组为21.6±5.6%（P=0.022）。结论盐酸埃克替尼能够抑制T细胞的增殖。

酪氨酸激酶抑制剂；肿瘤免疫；T淋巴细胞

盐酸埃克替尼是我国具有完全自主知识产权的小分子靶向抗癌创新药，临床研究表明盐酸埃克替尼在晚期非小细胞肺癌治疗过程中显示一定优越性[1]。有研究报道酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼[2]、达沙替尼[3]、厄洛替尼[4]能够抑制T细胞的增殖，但盐酸埃克替尼对T淋巴细胞的增殖有何影响，尚未见报道，故作者进行了相关研究，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料：①细胞：人外周血T淋巴细胞为从人外周富集血中分离；②细胞培养试剂：细胞培养液RPMI1640（美国Invitrogen公司），胎牛血清（美国Gibco公司），96孔培养板（美国Corning公司），Ficoll分离液（中国医学科学院血液学研究所），Pan T cell isolation kitⅡ（德国Miltenyi Biotec公司）。

1.2 设备：超净工作台（上海力申科学仪器有限公司），HEPA CLASS100加湿CO2孵箱（美国Thermo公司），JX70倒置显微镜及照相系统（日本Olympus公司），Synergy HT酶标仪（美国BioTek公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 T细胞的分离：取4 mL富集外周血，Ficoll分离法提取单个核细胞，应用Pan T cell isolation kitⅡ分选单个核细胞，分选柱下方所收集细胞即为T细胞。

1.3.2 T淋巴细胞的培养：所得T细胞以细胞培养液重悬，使细胞浓度为1.5×106/mL，以200 μL每孔接种到96孔板中。设对照组、盐酸埃克替尼组，对照组盐酸埃克替尼浓度为0 ng/mL，盐酸埃克替尼组设三个浓度：1000 ng/mL、2500 ng/mL、5000 ng/ mL；各组加入药物后于37℃加湿5%CO2孵箱中培养1 h，然后各组均加入佛波酯（PMA），终浓度分别为50 ng/mL，培养48～72h。

1.3.3 MTT法检测T细胞增殖情况：T淋巴细胞密度为1.5×106/mL，接种于96孔板中，每孔培养液200 μL，空白对照孔只加培养液。各组按1.3.2描述中加入药物，37℃，5%CO2饱和湿度细胞培养箱孵育72 h，每组每浓度设3个复孔。每孔加入5 mg/ mL MTT液20 μL，继续孵育4 h，离心培养板，吸弃上清，每孔加入DMSO150 μL，微量震荡器震荡10 min，490 nm波长下检测每孔的吸光度（OD）值。按下列公式计算抑制率：抑制率=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

1.4 统计学方法：采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，两组定量资料的比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

盐酸埃克替尼能够抑制T淋巴细胞的增殖。我们比较了实验组与对照组间的抑制率，盐酸埃克替尼组1000ng/m组为12.0±5.0%（P=0.053），2500ng/ mLl组为20.0±3.6%（P=0.011），5000ng/mL组为21.6±5.6%（P=0.022）。随药物浓度增加，抑制率有提高趋势，提示盐酸埃克替尼对T细胞增殖的抑制呈浓度依赖性。

3 讨论

盐酸埃克替尼是我国自主研制的、具有世界专利的治疗非小细胞肺癌的国家一类新药，在分子水平，盐酸埃克替尼抑制EGFR激酶活性的IC50（当50%酶活性被抑制时的抑制剂浓度）为5 nM，和国外上市产品相当。在测定了盐酸埃克替尼对85种激酶（包括其突变型）的抑制活性的结果显示，盐酸埃克替尼在0.5 μM（100倍于对EGFR激酶活性抑制的IC50）时对EGFR激酶的抑制特异性较高，没有显示出对其它激酶的抑制，表明盐酸埃克替尼是一个特异性较高的EGFR激酶抑制剂[5]。目前该药物已广泛应用于临床，并改善了肿瘤患者的生存，但该药物需长期应用，在用药过程中是否会影响T细胞的增殖，目前尚未见报道，我们对此进行了研究。为了更加贴近临床实际，我们选取人外周血中的T细胞作为研究对象，观察了盐酸埃克替尼对人T淋巴细胞增殖的影响。在实验设计过程中，我们尽量使实验条件与体内环境相似，药物浓度的选取以肿瘤患者服药后达到的稳态血药浓度为参考，实验药物浓度均在其附近。按临床常规剂量（125 mg tid）应用盐酸埃克替尼，稳态血药浓度为2500±378 ng/mL[6]，实验组药物浓度设为1000 ng/mL、2500 ng/mL、5000 ng/mL。MTT实验发现，盐酸埃克替尼能够抑制T细胞的增殖，仅在较高浓度时具有统计学差异。盐酸埃克替尼是通过何种机制抑制T淋巴细胞的增殖，目前已有酪氨酸激酶抑制剂影响细胞周期分布的报道，Ling等[7]已证实厄洛替尼通过诱导p27kip1的产生阻止细胞由G1期进入S期，从而实现G1期阻止，Qiong等[4]也发现厄洛替尼能够使活化T细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）抑制剂p27kip1的表达升高。舒尼替尼对细胞周期的影响亦有报道，Yanhong等[8]发现舒尼替尼能够使T细胞内细胞周期素D3和磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）减少，同时CDK6、CDK4磷酸化水平降低，从而实现G1期阻滞。杨彩玲等[9]研究发现盐酸埃克替尼通过降低人舌鳞状细胞癌Tca8113，改变Tca8113的细胞周期分布，有明显的G0/G1期阻滞作用，由此推断盐酸埃克替尼可能是通过影响T细胞的周期分布，从而影响T淋巴细胞的增殖。

［1］Shi Y，Zhang L，Liu X，et al.Icotinib versus gefitinib in previously treated advanced non-small-cell lung cancer（ICOGEN）：a random ised，double-blind phase 3 noninferiority trial［J］.Lancet Oncol，2013，14（10）：953-961.

［2］Dietz AB，Souan L，Knutson GJ，et al.Imatinib mesylate inhibits T-cell proliferation in vitro and delayed-type hypersensitivity in vivo［J］.Blood，2004，104（4）：1094-1099.

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［4］Luo Q，Gu Y，Zheng W，et al.Erlotinib inhibits T-cellmediated immune response via down-regulation of the c-Raf/ERK cascade and Akt signaling pathway［J］.Toxicol A，2011，251（2）：130-136.

［5］Tan F，Shen X，Wang D，et al.Icotinib（BPI-2009H），a novel EGFR tyrosine kinase inhibitor，displays potent efficacy in preclinical studies［J］.Lung Cancer，2012，76（2）：177-182.

［6］Zhao Q，Shentu J，Xu N，et al.Phase I study of icotinib hydrochloride（BPI-2009H），an oral EGFR tyrosine kinase inhibitor，in patients with advanced NSCLC and other solid tumors［J］.Lung Cancer，2011，73（2）：195-202.

［7］Ling Y H，Li T，Yuan Z，et al.Erlotinib，an effective epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，induces p27KIP1 up-regulation and nuclear translocation in association with cell growth inhibition and G1/S phase arrest in human non-small-cell lung cancer cell lines［J］.Mol Pharmacol，2007，72（2）：248-258.

［8］Gu Y，Zhao W，Meng F，et al.Sunitinib impairs the proliferation and function of human peripheral T cell and prevents T-cell-mediated immune response in mice［J］. Clin Immunol，2010，135（1）：55-62.

［9］杨彩玲，韩新光，于春亚.盐酸埃克替尼对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞周期及Cy-clinD1、P27表达的影响［J］.郑州大学学报（医学版），2011，25（1）：82-85.

The Effect of Icotinib on the Proliferation of T Lymphocyte

Han Guiliang Shi Yan Ren Guanying Wang Xiaolei

（Department of Oncology；Affiliated Hospital of Hebei University，Baoding 071000，China）

ObjectiveTo observe the effect of tyrosine kinase inhibitor（TKI）such as icotinib on T lymphocyte.MethodsTlymphocytes were selected from peripheral blood mononuclear cells by immunomagnetic cell sorting.Then the T lymphocytes were stimulated by Phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）and increasing dose of icotinib was added to the experimental group.After culturing 48-72 hours the proliferation rate of the T lymphocytes was analyzed by MTT.ResultsWe compared the inhibitory rate between the control group and experiment group，and we found that icotinib can inhibit the proliferation of T lymphocyte.ConclusionIcotinib can inhibit the proliferation of T lymphocyte.

Targeted therapy；Tyrosine kinase inhibitor；Tumor immunology

R453

A 学科分类代码：32067

1001-8131（2016）06-0639-02

2016-07-18