糖尿病肾病兔模型的建立及功能磁共振成像的可行性研究

王蕊，杨学东，赵凯，林志勇，隋雪晴，张晓东，王霄英



糖尿病肾病兔模型的建立及功能磁共振成像的可行性研究

王蕊，杨学东，赵凯，林志勇，隋雪晴，张晓东，王霄英

【摘要】目的：建立糖尿病肾病（DN）兔模型，并评价功能磁共振成像（f MRI）在早期DN兔模型中应用的可行性。方法：12只（7只实验组，5只对照组）新西兰大白兔禁食6～8 h后行基线肾脏MRI扫描，成像技术包括T2WI、血氧水平依赖（BOLD）成像、扩散加权成像（DWI）、氧摄取分数（OEF）成像、T1-map及动脉自旋标记（ASL）成像，均采集左肾轴面。随后实验组兔经耳缘静脉注射四氧嘧啶（100 m g／kg），72 h后检测静脉血糖水平，血糖浓度＞16 .0 m m ol／L认为糖尿病模型建立成功；对照组经耳缘静脉注射相同剂量0 .9 %生理盐水。建模成功后3 d，所有兔再次行肾脏MRI扫描，并处死取左肾病理，行HE、PAS、Masson染色。两名医师分别独立评价各序列图像质量。结果：实验组5只兔糖尿病模型建立成功，2只未成功，最终实验组5只、对照组5只完成实验。T2WI及各f MRI图像（BOLD、DWI、OEF、T1-map及ASL）均具有良好的图像信噪比（SNR）及空间分辨力，皮髓质分界清楚。造模成功后3 d病理显示实验组兔肾小管细胞空泡样变性，管腔轻度扩张，肾间质局灶淋巴单核细胞浸润，符合DN模型。结论：耳缘静脉注射四氧嘧啶（100 m g／kg）可成功建立DN兔模型，且无创性f MRI可应用于该模型的评估。

【关键词】糖尿病；糖尿病肾病；磁共振成像；疾病模型，动物

作者单位：100034 北京，北京大学第一医院医学影像科（王蕊、杨学东、赵凯、林志勇、隋雪晴、张晓东、王霄英）；100053 北京，中国中医科学院广安门医院放射科（杨学东）

糖尿病肾病（diabetes nephropathy，DN）是糖尿病患者最主要的并发症之一，但其发病机制等仍有许多未解决的问题［1-2］。目前，多采用动物实验的方法进行DN相关的基础研究，所用实验动物包括大鼠、小鼠等［3-4］。兔肾较大，较适合进行功能磁共振成像（functional magnetic resonance imaging，f MRI）扫描。本研究将探讨DN兔模型的建立以及f MRI应用于DN模型的可行性。

材料与方法

1 .实验动物

本研究经伦理委员会批准。12只健康雄性新西兰大白兔（购自北京大学第一医院实验动物中心），体重2 .5～4 .0 kg，自由采食法饲养。分为实验组7只、对照组5只。

2 .DN兔模型制备

将四氧嘧啶（Sig ma公司）用0 .9 %生理盐水配制为2 .5 %溶液，实验组兔经耳缘静脉按100 m g／kg剂量于1 min内注入，对照组兔注射相同剂量0 .9 %生理盐水。打药后72 h用血糖分析仪（美国Freestyle）测量末梢血糖，浓度＞16 .0 m m ol／L则糖尿病模型建立成功［5-6］。

3 .MRI检查

使用3 .0 TMR扫描仪（Signa ExciteTM，GEMedical System，Milwaukee，Wis）。因兔右肾容易受到运动及肠气等伪影影响而导致图像质量欠佳，故本实验仅扫描左肾。于造模前（基线）和造模成功后第3d分别对实验组及对照组兔行MRI扫描，扫描前实验组及对照组兔均禁食6～8 h，自由进水。扫描前5 min固定兔，经面罩给予吸入式麻醉剂异氟烷，并观察兔反应，肌力消失、瞳孔散大、角膜反射减弱或消失可认为麻醉成功。采用8通道膝关节表面线圈，兔呈仰卧位，足先进，为防止腹部呼吸运动对图像的干扰，在兔腹部与膝线圈间填充垫子。成像技术包括：左肾轴面T2WI、血氧水平依赖（blood oxygen level dependent，BOLD）成像、扩散加权成像（diffusion weighted imaging，DWI）、氧摄取分数（oxygen extraction fraction，OEF）成像、T1-map及流动敏感交互反转恢复-动脉自旋标记（flow-sensitive alternating inversion recovery-arterial spin labeling，FAIR-ASL）成像，扫描参数详见表1。

表1　各成像技术的扫描参数

4 .扫描方法

T2WI扫描范围覆盖左侧全肾，采用快速自旋回波（fast spin echo，FSE）序列。BOLD成像采用2 D多回波梯度回波（m ultiple gradient echo，m GRE）序列，回波链为12个，回波间隔为2 ms，扫描1层，层面为左肾门水平。DWI采用自旋回波-回波平面成像（spin echo-echo planar imaging）序列，b值取0和800 s／m m2，为提高空间分辨力，采用轴面小FOV扫描，层数3层，中间层面位于左肾门水平，同时在左肾外缘设置预饱和带，以消除腹腔肠管磁敏感伪影的干扰。OEF成像、T1-map技术、ASL成像均采集左肾门水平，层数为1层。OEF成像采用多回波梯度自旋回波（m ulti echo gradient and spin echo，MEGSE）技术，在一个TR间期内获得32个回波，其中第7个回波是SE，前后为不对称分布的GRE，因此可同时获得T2和T2*信号，并利用Yablonskiy等［7-10］提出的MRI信号衰减模型而最终计算出OEF。T1-map采用3 D扰相梯度回波（spoiled gradient recalled，SPGR）序列，分3个循环，每次循环只改变翻转角，其他参数不变。ASL成像采用单激发快速自旋回波（single-shot fast spin echo，SSFSE）序列，分2次循环，第1循环采集对照相及标记相图像，第2循环关闭血管标记，以获得M0图像。

5 .图像后处理

BOLD成像及DWI图使用AW4 .2中的Functool软件进行处理。OEF成像、T1-map技术、ASL成像图使用Matlab软件进行分析。

6 .图像质量评估

所有图像均上传至AW4 .2工作站，由两名有经验的影像学医师采用盲法分别对各f MRI图进行质量评价。根据图像有无伪影及变形，是否能分辨肾内结构等将图像质量分为优、好、差3个等级。优：无伪影、变形，肾内结构清晰可辨；好：轻度伪影或变形，肾内结构可辨；差：明显伪影或变形，肾内结构无法辨认。

7 .组织学检查

实验结束后处死所有动物，取左肾，在肾门水平取3～5 m m切片，用10 %福尔马林固定24 h取材，用石蜡包埋、切片，行HE染色、碘酸雪夫反应（PAS）染色、马松（Masson）染色和封固。光镜下观察肾组织形态学变化。

8 .统计学分析

使用SPSS16 .0统计学软件进行分析。两名观察者之间图像质量评分采取Kappa分析判断其一致性，其中Kappa值＞0 .75为一致性良好，0 .4≤Kappa值≤0 .75为一致性较好，Kappa值＜0 .4为一致性差。

结 果

1 .DN模型的建立情况

实验组7只兔中5只糖尿病模型制备成功，2只打药后72 h血糖浓度＜16 m m ol／L，最终，实验组及对照组各5只完成实验，故最终评估实验组5只和对照组5只的基线及造模成功后3d扫描的MRI图像。

实验结束后处死动物并取左肾，对照组兔形态及色泽正常，表面光滑，光镜下皮质肾小球结构清晰，未见肥大，肾小球基膜未见增厚，肾小管形态正常，未见空泡样变性及坏死，集合管未见管型。实验组兔均可见光镜下肾小球系膜细胞增生，肾小管细胞空泡样变性，管腔轻度扩张，肾间质局灶淋巴单核细胞浸润，故认为实验组5只均成功建立DN模型。

2 .MRI图像质量评价

左肾MRI图像中，T2WI可清楚显示左肾皮质（cortex，CO）、外髓外带（outer stripes of the outer medulla，OS）、外髓内带（inner stripes of the outer medulla，IS）及内髓（inner medulla，IM）（图1），并与左肾大体病理横轴面相对应（图2）。图3～7分别为BOLD成像、DWI、OEF成像、T1-map技术、ASL成像图像，均可清楚显示CO、外髓（outer medullar，OM）和IM。10只兔子均于基线、造模成功后3 d进行MRI扫描，其结果均参与评价。两名观察者一致性显示：T2WI图像质量均为“优”（“优”均为20），Kappa值1 .00；BOLD成像图像质量均达到“好”（其中“优”均为12），Kappa值0 .79；DWI图像质量均达到“好”（其中“优”分别为10和11），Kappa值0 .70；OEF成像图像质量均达到“好”（其中“优”分别为14和15），Kappa 值0 .88；T1-map图像质量均达到“好”（其中“优”分别为8和9），Kappa值0 .69；ASL成像图像质量均为“优”（“优”均为20），Kappa值1 .00。

讨 论

DN是糖尿病常见的重要并发症。我国DN发病率逐年增多，在终末期肾病的病因中已位列第二，仅次于各种肾小球肾炎［11］。如果DN诊治不及时，发展到肾病末期，则只能透析甚至进行肾移植［12］。在DN发病过程中伴随着复杂的病理生理改变，由于以糖尿病患者作为研究对象的局限性，多以实验动物为研究对象，本文以早期DN兔模型为研究对象，探讨无创性f MRI用于兔模型实验的可行性。

DN模型制备方法有：化学药物诱导、自发性DN动物模型、手术切除胰腺、转基因动物等［3，13］。自发性DN动物模型虽在一定程度上减少了人为因素，更接近自然状态下的人类疾病进程，但动物饲养条件要求高、发病率低、且病程长、耗费大。手术切除易形成恶性糖尿病，死亡率高。而转基因动物技术要求高，价格昂贵。故目前多采用化学药物诱导法进行模型制备，本研究采用四氧嘧啶，通过破坏兔胰岛β细胞从而导致胰岛素缺乏，形成不可逆的胰岛素依赖性糖尿病，随病程进展形成DN。目前常用的DN动物模型为大鼠和兔，因大鼠肾脏体积小，不利于f MRI检查及反复采血［4］，故本文采用新西兰兔行模型制备。

文献报道［14］实验动物注射四氧嘧啶前应禁食、水24 h。本研究的预实验发现兔禁食24 h后，肠腔内容物较少，但积气明显增多，肾脏位于肠管后方，易受磁敏感伪影的影响；而禁食6～8 h既可减少肠腔内容物，又无过多肠道积气。本研究采用四氧嘧啶（100 m g／kg）耳缘静脉注射，给药后72 h模型成功率达71 %，略低于文献报道［6］，可能与实验动物数量少有关。

由于腹部肠道气体及呼吸运动等影响，目前，f M-RI在腹部脏器中的应用尚存在一定挑战性。本研究在实验过程中发现，由于兔双肾在腹腔内的相对距离较大，且右肾多随肝脏移位至胸腔（图像受胸腔呼吸及气体伪影干扰重），因此仅采集左肾图像。使用麻醉机以保证实验过程中动物麻醉深度一致。在摆位过程中，先将兔腹部倾向右侧，将肠管推移至右侧，以减少左肾周围肠管，从而减少扫描过程中磁敏感伪影。并将兔与线圈之间的空间用垫子填充，以减少呼吸运动伪影。

肾脏的f MRI研究中，DWI和BOLD成像的相关研究较多［15-18］。DWI作为目前唯一能无创性检测活体组织中水分子扩散运动的方法，已广泛应用于临床及科研。本研究为提高空间分辨力，采用小FOV扫描，病灶FOV外围设置预饱和带，以消除肠管造成的磁敏感伪影及卷褶伪影干扰。BOLD成像技术依赖于组织血氧水平变化。1936年Pauling等首次发现去氧血红蛋白具有顺磁性，从而推测血液的磁性有赖于其氧合水平。1990年，Ogawa等［19］发现血液中顺磁性的脱氧血红蛋白使血管和周围组织间产生较大的磁敏感差异，从而产生血氧水平依赖增强效应。但仅靠BOLD成像技术，无法解释肾脏氧合水平低下是由肾脏血供减少和／或氧代谢增加造成的［20］。因此，不少研究探讨了ASL成像及OEF成像的可行性，并已验证ASL在肾脏、OEF成像在脑部应用中的可行性［21，22］。

ASL成像在不引入对比剂的前提下，通过磁化标记内源性血液来量化评估肾脏血流量。研究表明，与动态增强相比，ASL技术具有无创、安全的特性，尤其适用于肾功能不全的患者。目前已有部分研究使用BOLD成像及ASL成像来评价正常肾脏及肾脏干预前后氧合水平及肾血流量的变化［20，21，23-25］，但动物模型以大鼠为多，而本研究以兔为实验对象，图像信噪比高，皮髓质分界清晰。氧代谢是维持机体正常新陈代谢的重要生理活动，因此组织氧代谢指标的定量测定对相关疾病的病理认识及诊断具有非常重要的指导作用。OEF成像可以无创性地获得组织氧摄取分数，最初被用于脑组织的相关研究中，关于肾脏方面的研究报道较少［26］。MEGSE序列通过连续激励非对称性偏倚180°重聚脉冲，同时保持TE时间不变，从而使采集的MR图像信号只与磁场的不均匀性变化有关，以消除T2效应的影响。从Yablonskiy等［7］的模型可知，如果将组织局部磁敏感效应的总强度用R2′来表示，那么在稳态条件下，R2′与组织毛细血管静脉血容量λ及血管内d Hb O2含量（即OEF）呈正相关。本研究首次应用OEF成像来评估DN兔肾组织的氧摄取分数，所有图像质量均达到“好”，伪影小，肾脏皮髓质分解清晰，可用于评估。

本研究仍有很多不足之处：第一，实验组样本量小，两观察者对图像质量评估的一致性Kappa值可能缺乏稳健性，在后续研究中仍需进一步扩充样本量；第二，本研究模型成功率略低于文献报道，仍需进一步优化。

综上，经耳缘静脉注射四氧嘧啶可以成功建立DN兔模型，无创性f MRI可成功应用于DN兔模型的评估。

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·糖尿病影像学专题·

Establish ment of rabbit model of diabetic nephropathy and study on feasibility of renalfunctional MRimaging

WANGRui，YANGXue-dong，ZHAOKai，etal.Department of Radiology，Peking University First Hospital，Beijing 100034，P.R.China

【Abstract】Objective：To establish the rabbit m odel of diabetic nephropathy（DN）and evaluate the feasibility of functional MRimaging in studying the kidney of DNrabbits .Methods：Twelve New Zealand rabbits were enrolled and divided into 2 groups：7 rabbits in the experiment group and 5 rabbits in the control group .Rabbits in experiment group were intravenously injected with alloxan in the dosage of 100 m g／kg and rabbits in control group were intravenously injected with the same dosage of 0 .9 % saline .Blood glucose levels were checked 72 hours after the alloxan injection and rabbits with blood glucose levels of 16 .0 m m ol／Lor higher were identified as successful diabetes mellitus m odel.MRimaging was performed before alloxan injection（baseline）and 3 days after the m odel established successfully，respectively .Then，the rabbits were sacrificed and the left kidneys were taken for pathological examination .MRimaging included T2WI，blood oxygen level dependent（BOLD），diffusion weighted image（DWI），oxygen extraction fraction（OEF），T1-map and arterial spin labeling （ASL）.The image quality was evaluated by two radiologists independently .Results：For DNgroup，5 rabbits were detected with blood glucose level＞16 .0 m m ol／Lafter 72 hours of alloxan injection and 2 rabbits were detected with blood glucose level＜16 .0 m m ol／L.Finally，5 rabbits in control group and 5 in DNgroup finished the study .Renal damages of DNgroup included swelling and mild vacuolation of renal tubular cell and ly m phocytes infiltration .The image quality of each MRsequence all reached the standard of "good" .Conclusion：DNm odel can be induced in rabbits with 100 m g／kg alloxan injection . Also，satisfactory functional MRimaging can be obtained in rabbit kidney of DNm odel.

【Key words】Diabetes mellitus；Diabetic nephropathies；Magnetic resonance imaging；Disease m odels，animal

收稿日期：（2015-12-20 修回日期：2016-01-10）

基金项目：教育部博士点新教师基金（20110001120053）及首都卫生发展科研专项项目（首发2011 - 4021 - 02）

通讯作者：杨学东，E-mail：yangxuedong1＠163 .co m

作者简介：王蕊（1999 -），女，河南南阳人，博士研究生，主要从事MR新技术工作。

DOI：10 .13609／j.cnki.1000-0313 .2016 .02 .004

【中图分类号】R587 .24；R445 .2；R- 332

【文献标识码】A

【文章编号】1000-0313（2016）02-0113-05