减味寿胎丸对复发性自然流产（RSA）小鼠蜕膜中树突状细胞（DCs）表达干预研究

方家　刁军成　李林

【摘要】目的：研究减味寿胎丸对复发性自然流产（RSA）小鼠蜕膜中树突状细胞（DCs）表达干预。方法：建立成熟、完善的RSA小鼠蜕膜的DCs体外培养体系。检测正常妊娠和RSA小鼠蜕膜中CD83+、CD1a的表达，以及CCLl7和CCL22的表达，探讨DCs在母胎免疫耐受机制中的可能作用以及与URSA的关系。探讨寿胎丸对RSA小鼠对蜕膜DCs表达的影响，从而探讨中药对DCs影响母胎免疫耐受的干预机制。结果：RSA小鼠的蜕膜中CD83+、CD1a；CCLl7和CCL22表达与正常妊娠组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；RSA小鼠的血清HCG和P值与正常妊娠组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：减味寿胎丸可以通过提升小鼠血清HCG、P值；降低CD83+的表达，提高CDla+的表达；增加母胎界面CCLl7、CCL22表达，从而起到多途径防治RSA的目的。

【關键词】减味寿胎丸；复发性自然流产；树突状细胞

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）01-0012-02

自然流产指妊娠在28周以前终止、胎儿体重在1000g以下者，发生率15%～20%。如自然流产连续发生2次或2次以上称为复发性自然流产（recurrent spontaneous abortion RSA），发生率约1%[1]。妊娠是一种成功的同种异体移植现象，胎儿胎盘作为母体半同种异体移植物和妊娠免疫识别单位，其成功有赖于妊娠母体的免疫耐受，这种耐受一旦被破坏，则导致病理性妊娠，如流产、妊娠期高血压疾病等。RSA已知的病因有染色体异常、生殖器官畸形、内分泌失调、感染、免疫、环境理化等。近代生殖免疫研究表明[2]，约50%～60%的RSA与免疫有关，RSA的免疫学病因日益受到重视。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雌性CBA/J小鼠，10周龄，体重20g，60只。雄性BALB/c小鼠，10周龄，体重20g，15只。雄性DBA/2小鼠，10周龄，体重20g，15只。由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号： No.44005900000741/ No.44005900000742。

1.1.2 药品与试剂 ①醇提+醇提后水提方法所提取的减味寿胎丸复方（菟丝子400g、桑寄生300g、续断300g分别制备复方醇提物和复方水提物，将两者合并既得减味寿胎丸复方总提物样品。②地屈孕酮片（达芙通）：荷兰Abbott Biologicals B.V，规格：10mgX20片 批号：344033。③小鼠可溶性CD1a、CD83、CD86（B7-2/sCD86）ELISA Kit.④小鼠胸腺活化调节趋化因子（TARC/CCL2、CCL17、CCL22）ELISA。

1.1.3 实验仪器 全自动血细胞分析仪（XE-5000 日本Sysmex公司）、放免Y测量仪（SN-695B 上海日环仪器厂）、酶标仪（Bio-TekELX-800奥林巴斯）、生物显微（CX21BIM-SET奥林巴斯）、超低温冰箱、电子天平、电热恒温水浴箱 、离心沉淀机、50ml烧杯、特制塑料筒（内径约3Cm），恒温照明灯、眼科镊、缝针、丝线、持针器、注射器、灌胃针头、解剖台、烧杯、试管、小动脉插管、小血管夹、微量加样器、胶头滴管等。

1.2 方法

1.2.1 RSA小鼠造模方法 将雌性CBA/J小鼠（英文名：CBA/J mouse；分类地位：脊椎动物门、哺乳纲、啮齿目、鼠科、鼹鼠属、小鼠种、CBA/J小鼠品系；具有可提供研究的活体动物；饲养条件：屏障系统；微生物学等级：SPF级；类别：近交系；品系描述：CBA/J小鼠是CBA/J品系小鼠的其中一个亚系，其携带有Pde6brd1突变，该突变基因可使小鼠幼年时就失明。CBA/J一般用于研究肉芽肿型实验性自动免疫性甲状腺炎。对饮食诱导的动脉粥样硬化有很好的的抵抗性，在小鼠年老时会逐步出现微弱的听力损失情况，肾小管间质病变概率较高。雌鼠可能有习惯性流产。应用领域为肉芽肿型实验性自动免疫性甲状腺炎 视网膜退化变性 习惯性流产 听力损失）分别与雄性DBA/2（1909年C.C. Little从因毛色而分离出来的品系培育而成，是最早的一个近交系小鼠，常用于肿瘤学、遗传学和免疫学等方面的研究）和BALB/c小鼠（BALB/c 是白变种实验室老鼠，与众多常用亚系一样，起源于小家鼠Mus musculus。从1920年它们在纽约诞生至今，BALB/c小鼠在全球研究机构繁衍了超过200代，广泛用于免疫学、生理学的动物实验。）合笼交配[1]，检出阴栓者计为妊娠第1天，分别建立反复自然流产模型30只与正常妊娠模型10只。

1.2.2 分组及给药方案 按妊娠顺序随机分为RSA模型组（A）、RSA达芙通组（B）、RSA减味寿胎丸组（C）、正常妊娠模型组（D），自妊娠第1天开始灌胃，分早晚两次给药，直至孕14d取材。

1.2.3 观察指标 ①一般情况形态、毛色、活动、纳食、大便等。②解剖后观察子宫口及子宫形态、颜色、官腔内变化；正常胚胎数、流产胚胎数。③血清HCG、P值。④蜕膜中CD83+、CD1a值。⑤蜕膜中CCLl7、CCL22。

1.2.4统计学方法 将实验所得的数据输入计算机，建立Excel数据库，进行数据管理，应用SPSS 21.0和SAS 9.2统计软件进行分析。计量资料：若数据符合方差齐，正态分布，多组独立样本采用方差分析，组间两两比较使用LSD检验； 两独立样本比较采用t检验，组内治疗前后自身比较采用配对t检验；不符合正态性分布的多组样本则采用多组数据的秩和检验，组间两两比较采用Nemenyi法检验；不符合正态分布的两独立样本比较，采用Wilcoxon秩和检验，组内治疗前后自身比较采用配对秩和检验（Wilcoxon法）。

2 结果

2.1 RSA小鼠与正常妊娠小鼠一般状态的比较 RSA小鼠与正常小鼠一般状态良好、毛色光滑、反应灵活、体重呈稳步增长、食欲量好、大便正常。给药期间无不良反应。

解剖后肉眼见正常妊娠小鼠子宫为光洁粉红色，呈结节状膨大，发育良好，胚胎之间界限清晰，周围血供丰富，解剖后见胚胎完好；RSA小鼠子宫膨大的结节小于正常妊娠组，胚胎数目无明显差异；胚胎有明显瘀血痕迹。

第1天、第5天和第10天的各组小鼠解剖后各组子宫重量比较，差异无统计学意义（P>0.05）；各组小鼠正常胚胎数和流产胚胎数比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 减味寿胎丸对RSA小鼠血清HCG、P的影响 表1结果显示，B组和C组小鼠的血清HCG值与A组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；D组小鼠的血清HCG值与A组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；B组和C组小鼠的血清HCG值与D组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；B组和C组小鼠的血清HCG值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

B组和C组小鼠的血清P值與A组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；D组小鼠的血清P值与A组比较，差异有统计学意义（P<0.01）；B组和C组小鼠的血清P值与D组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；B组和C组小鼠的血清P值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.3 减味寿胎丸对RSA小鼠的蜕膜中CD83+、CD1a的影响 表2结果显示，B组和C组小鼠的CD83+、CD1a表达与A组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；D组小鼠的CD83+、CD1a表达与A组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；B组和C组小鼠的CD83+、CD1a表达与D组比较，差异无统计学意义（P>0.05）；B组和C组小鼠的CD83+、CD1a表达比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 减味寿胎丸对RSA小鼠母胎界面的蜕膜中CCLl7、CCL22的影响 表3结果显示，B组和C组小鼠的CCLl7、CCL22与A组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；D组小鼠的CCLl7、CCL22与A组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；B组和C组小鼠的CCLl7、CCL22与D组比较，差异无统计学意义（P>0.05）； B组和C组小鼠的CCLl7、CCL22比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

寿胎丸源于《医学衷中参西录》，由菟丝子、桑寄生、川断、阿胶四味中药组成，主治滑胎。临床研究证实[2]寿胎丸有增强免疫应答、提高封闭抗体效应的作用等。此方已在多年的实验研究下从多层面如PR、ER、Th1、Th2、IL-2、IL-10、TGF-β1等指标已证实了治疗反复流产疗效性及在免疫学方面的贡献。方中重用菟丝子补肾益精，壮胎元以安胎，以为君药。桑寄生养血强筋骨，以使胎气强壮而安胎；川断也是补肾要药，能够固冲安胎；以上共为臣药。上述三味同用，能使肾气旺盛，精血充沛，自能固胎。再兼阿胶补血、止血，使血脉安伏以养胎安胎，是为臣使之药。综合全方，共奏补肾养血、固摄安胎之效，大量临床报道本方治疗反复自然流产疗效显著。菟丝子为补肾安胎代表方寿胎丸的君药，黄酮类化合物为菟丝子主要化学成分。菟丝子总黄酮[2]可降低流产模型的流产率，逆转流产胎盘、蜕膜结构的病理改变，同时能提高孕激素水平，促进蜕膜孕激素受体的表达，调节Th1/Th2型细胞因子平衡的作用，改善蜕膜、滋养细胞凋亡和增殖状态，提示菟丝子总黄酮可能是菟丝子补肾安胎的主要药效物质基础。

为深入研究寿胎丸防止自然流产的药效学物质基础及其作用机制，博士导师团队以肾虚型黄体功能抑制病证结合动物流产模型为载体，通过观察不同提取方法寿胎丸复方对模型动物影响的药效试验确立了寿胎丸复方的提取方法，研究结果表明[2]，醇提+醇提后水提方法所提取的寿胎丸复方补肾安胎效果最佳。并采用数学方法均匀设计与计算机结合技术，将均匀设计改良应用于寿胎丸的研究，定性的得到了寿胎丸的优选方及其药物组成原理和配伍关系，明确了该方最佳药效组合及配伍剂量（优选方），并经药效实验证实去阿胶的减味寿胎丸具有与寿胎丸基本相同的安胎效果。

长期以来，由于缺乏特异性的树突状细胞（Dendritic cells DCs）鉴定方法，给人们研究DCs造成了一定的困难，以致很长一段时间内研究者把DCs误以为是巨噬细胞。研究发现，DCs的主要特异性标志物是CD83和CD1a，本研究选取公认的CD83、 CDla作为成熟、未成熟DCs的标记物，进行ELISA检测实验，观察RSA小鼠蜕膜组织中CD83+、CDla+DCs的分布、数量等情况。探讨DCS的功能状态与RSA的关系，为揭示RSA的发病机制、防治RSA提供新的思路。已有实验表明[3]人体正常妊娠后DC表达CCLl7、CCL22增强，DC可能通过高表达CCLl7、CCL22对CD4+CD25+T细胞趋化作用增强，从而在母胎界面的免疫耐受中发挥调控作用。其表达CCLl7、CCL22的能力降低可能与RSA流产的发病有关。我们以此为切入点，展开了CCL17、CCL22在母-胎界面生物学功能的研究，以阐明母胎界面蜕膜基质细胞和蜕膜免疫活性细胞间相互对话的分子和机制，进而揭示趋化因子在母-胎界面免疫调节网络中的作用。本研究发现，减味寿胎丸可以通过提升小鼠血清HCG、P值；降低CD83+的表达，提高CDla+的表达；增加母胎界面CCLl7、CCL22表达，从而起到多途径防治RSA的目的。

参考文献

[1]尤昭玲，何冬梅，赖毛华.正常妊娠与反复自然流产小鼠母胎界面SOCS1、SOCS2、SOCS3蛋白表达的差异.中国妇幼保健[J].2008.23：5192.

[2]郜洁.寿胎丸的药物组成及其补肾安胎的药效学研究.博士论文[D].广州：广州中医药大学，45，2009.

[3]Compp C， Thurnau G R， et al. Functional and immunologic Protein S levels Are decreased during Pregnancy Blood[J]. 2010， 68（18）： 881-555.

（收稿日期：2015.11.06）