一种简易小鼠原代肝细胞分离方法

周 萍， 樊 静， 梁

(成都大学 四川抗菌素工业研究所， 四川 成都 610052)

一种简易小鼠原代肝细胞分离方法

(成都大学 四川抗菌素工业研究所， 四川 成都 610052)

对小鼠原代肝细胞分离方法进行改良，通过简单且经济的方法获得小鼠原代肝细胞，采用4.5号输液针经下腔静脉逆行灌流，用长条状纸板对针进行固定，以获取质量稳定的小鼠原代肝细胞悬液.结果显示，改进后的方法灌流成功率高及重现性好并可获得实验所需肝细胞，细胞对台盼蓝拒染率>90%.方法操作简单，成本较低且效率较高.

灌流;小鼠原代肝细胞;Ⅳ型胶原酶

0 引 言

小鼠原代肝细胞是肝脏疾病及体外肝毒性研究的重要工具，探索一种简单且经济的小鼠肝细胞分离方法非常具有实际意义.相对于大型动物及人体原代肝细胞，小鼠原代肝细胞更经济且易获取.肝细胞的经典分离方法是Seglen两步原位灌注法[1]，该方法适用于大鼠以及较大动物肝细胞的分离.近年来，在Seglen两步原位灌注法基础上发展而来的适用于小鼠肝细胞分离方法有门静脉灌流[2]、下腔静脉灌流[3]、心脏逆行灌流[4].在实验中发现，因小鼠门静脉血管细小，壁薄易被输液针扎破而导致灌流失败或灌注不均匀较难穿刺并置管成功，但小鼠的下腔静脉血管比其门静脉血管粗，经下腔静脉的灌流方法比门静脉更易置管成功.文献报道的小鼠灌流多采用留置针及灌流泵，留置针的灌流采用手扶固定或胶带固定，容易出现针固定不好而脱落的情况，采用纸板固定针头能够很好避免针脱落.小鼠肝脏体积小，细微的灌流泵调节都会引起小鼠肝内压力骤变而对肝细胞造成损伤，或使肝脏及相关血管因压力过大而破裂漏液，采用注射器推注的方式能够较好地避免因灌流泵调节的灌流压过大所致的肝脏或血管涨裂的情况发生，且简单易行.在此基础上，本实验改良了灌流方式，采用4.5号输液针，对灌流针的进针位置及灌流针固定方法进行了探索，拟建立一种简单且经济的灌注实验方法，以降低人为操作的影响及实验成本.

1 材料与方法

1.1 动 物

实验所用动物为：KM小鼠40只(22±2 g，雌雄不限)，由成都达硕实验动物有限公司提供，饲养于SPF系统中.

1.2 试 剂

实验所用试剂包括：胎牛血清(杭州四季青生物有限公司)，EGTA、胰岛素、地塞米松(sigma)，D-HANKS(Gibco公司)，鼠尾胶原蛋白Ⅰ型(solarbio C8062)，台盼蓝(sigma T6146)，高糖DMEM(HyClone)，青链霉素(solarbio)，HEPES(Amresco).

1.3 溶液配制

1)灌流液Ⅰ配制.将0.019 g EGTA溶于100 mL D-HANKS，用NaOH溶液调至pH值为7.2～7.4.

2)灌流液Ⅱ配制.Ⅳ型胶原酶40 mg溶于100 mL高糖DMEM.

3)醋酸溶液的配置.34.3 μL冰醋酸用蒸馏水定容到100 mL，配置成0.006 mol/L醋酸溶液.

4)水合氯醛.称取0.8 g水合氯醛溶解于20 mL生理盐水.

5)100 nmol/L地塞米松.精密称取地塞米松19.5 mg溶于1 mL无水乙醇，取100 μL加入到50 mL DMEM中，分装，-20 ℃低温冷藏.

6)10 nmol/L胰岛素.精密称取胰岛素2.9 mg溶于pH值为2～3的50 mL盐酸中超声溶解，分装，-20 ℃低温冷藏.

7)细胞培养液的配制.10%胎牛血清、0.5 mL青链霉素、44.5 mL高糖DMEM、5 μL胰岛素，50 μL地塞米松.

1.4 小鼠肝细胞分离及培养

取0.006 mol/L冰醋酸3 mL及鼠尾胶原6 μL加入3.5 mm细胞培养皿，摇匀，密封，4 ℃静置过夜，轻吸出细胞培养皿残余液体，超净台内烘干，PBS冲洗3次，备用.灌流液Ⅰ及灌流液Ⅱ现用现配，灌流液Ⅱ40 ℃提前水浴1 h，灌流液Ⅰ临用时放入40 ℃水浴.固定小鼠，经腹腔注射0.35 mL水合氯醛麻醉，75%酒精喷洒腹部皮肤,分离腹部皮肤，换手术器械后剪开腹腔，将肠管及肠系膜轻轻翻向小鼠左侧，暴露出门静脉及下腔静脉，注射器吸取灌流液并排尽空气，在针柄处用胶带固定一张长条状灭菌纸板.下腔静脉穿刺，使针尖位置稍微高于2 mm肾静脉，血管夹固定进针处以防止灌流液倒流，小心将纸板固定，轻轻推注，通过肝脏轻微膨大判断进针成功与否(见图1)，对照组针柄用医用胶带固定.灌流液Ⅰ缓慢推入，并剪断门静脉灌流至肝脏呈现土黄色(约40 mL).然后将灌流液Ⅱ缓慢推入(约12 mL)，用镊柄处按压门静脉，肝稍微膨大，停止推注并在30 s后放开，每推1 mL轻轻按压一次,肝脏呈现土黄色并塌陷，灌流结束，剪下肝脏，去除胆囊，将肝脏转移至盛有8 mL左右细胞培养基中，撕开肝包膜，用眼科镊夹住肝蒂轻轻晃动，200目细胞筛网过滤，得到肝细胞悬液.500 r/min离心2次，调整肝细胞的密度，每个培养皿接种肝细胞1×106，于37 ℃温箱中培养，4 h以后观察并换液，细胞培养观察.

图1 经下腔静脉逆行灌注肝脏，输液针针柄处纸板固定

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，统计的数据资料应用样本率的χ2进行比较，检验水准α=0.05.

2 结 果

2.1 小鼠灌流成功率

在实验组25例和对照组15例中，实验组和对照组分别有24例和9例一次性穿刺成功并固定，分别各有1例出现灌注不均匀，其中对照组有4例出现液体外渗，针刺破血管而导致小鼠出血性死亡，1例出现未能成功穿刺导致出血性死亡.经统计软件SPSS计算p<0.05，实验组和对照组灌流成功率差异具有统计学意义.

2.2 细胞存活率与培养

分离出的小鼠肝细胞经台盼蓝染色，拒染率在90%以上，接种于35 mm细胞培养皿，体外培养4 h，倒置于显微镜下观察细胞形态，可以看到95%以上的细胞呈典型的肝细胞形态:细胞呈多边形，界限清晰，胞体透明，核呈圆形，大部分细胞为双核或多核(见图2).肝细胞能够培养一周，可满足肝细胞体外实验需求.

a.接种前，小鼠原代肝细胞经台盼蓝染色，细胞透亮呈圆形或卵圆形，较少的细胞被染色;b.肝细胞接种3.5 h，肝细胞贴壁，伸展，变薄，呈圆形或多边形，边界明显，可见大量双核，部分三核及单核细胞；c、d.肝细胞接种24 h，肝细胞牢固贴附于培养皿上，拉平变薄，呈椭圆形或多边形，边界轮廓清晰，细胞核位于正中，可见大量双核及多核细胞.

图2 显微镜下观察小鼠原代肝细胞

3 讨 论

近年来，适用于小鼠肝脏灌流方法有门静脉灌流、下腔静脉灌流、心脏逆行灌流等.通过这些灌流方法都能分离高活力小鼠原代肝细胞.小鼠门静脉细小，较难穿刺置管成功，且小鼠灌流时因呼吸而牵动灌流针，常常会降低灌流成功率.经心脏逆行置管灌注法需要剪开胸腔，通过心房插入肝脏上下腔静脉并分离结扎门静脉以及下腔静脉，这对实验人员操作技能要求较高，需要较长时间才能够掌握.此外，小鼠肝脏灌流操作中需使用灌流泵及留置针，成本较高.本研究对经下腔静脉的小鼠肝脏灌流方法进行了改良，采用更经济易获取的4.5号输液针代替留置针，采用人工推注方法代替灌流泵，避免了因灌流泵流速过大而导致小鼠肝脏破裂，以及开始灌流流速过慢而导致小鼠肝脏血淤的情况发生.长条纸板固定针柄处代替传统胶带或手固定方法，能够有效避免针脱落，降低人为影响.改良后的小鼠肝脏灌注因其简便易行，可明显节约实验成本、提高工作效率及灌流成功率.

在肝细胞分离及培养的过程中，培养液及灌流液的钙离子浓度、pH值、温度、酶浓度、流速以及灌流成功率直接影响肝细胞质量及数量[5]，优化并控制这些条件便能获得高质量肝细胞.本实验中，灌流液Ⅰ按照每只小鼠2 mL/g，灌流液Ⅱ按照每只小鼠0.5 mL/g±2 mL，灌流液pH值维持在7.2～7.4，灌流液Ⅰ流速应控制为灌流开始推注速度较快以防止肝脏形成槟榔状斑块，最后稳定在18～20 mL/min，灌流液Ⅱ推注速度稳定在4～6 mL/min，灌流液温度稳定在38～40 ℃，取得的单细胞状态较好.

目前，小鼠原代肝细胞分离方法包括灌注分离法[6-8]、胰蛋白酶消化法[9]和组织块法[10].本实验室发现，胰酶消化得到的细胞数量较少且杂细胞较多，难以获得常规实验所需的细胞数量，且因胰蛋白酶酶对细胞损伤过大，肝细胞存活率太低不能满足实验需求.组织块法多用于幼年动物，成年小鼠不推荐胰蛋白酶消化法和组织块法分离原代肝细胞.本实验采用的小鼠肝脏灌流方法的改良，操作简单易掌握，操作程序及手术程序简单可控，提高了工作效率，具有较高的推广价值.

[1]Seglen P O.Preparationofisolatedratlivercells[J].Methods Cell Biol,1976,13(13):29-83.

[2]Zheng J Y,Chuan P,Ai Y B,et al.Docosahexaenoicacidamelioratesfructose-inducedhepaticsteatosisinvolvingERstressresponseinprimarymousehepatocytes[J].Nutrients,2016,8(1):55.

[3]Ghose R,Mallick P,Taneja G,et al.InvitroapproachestostudyregulationofhepaticcytochromeP450(CYP) 3Aexpressionbypaclitaxelandrifampicin[J].Methods Mol Biol,2016,1395:55-68.

[4]余招焱,白燕南,张涛,等.经心脏逆行置管灌注法在小鼠原代肝细胞分离中的应用[J].四川大学学报(医学版),2014,45(1):138-141.

[5]Li W C，Ralphs K L,Tosh D,et al.Isolationandcultureofadultmousehepatocytes[J].Methods Mol Biol,2010,633(8):185-196.

[6]Itoh Y,Sanosaka M,Fuchino H,et al.Salt-induciblekinase3signalingisimportantforthegluconeogenicprogramsinmousehepatocytes[J].J Biol Chem,2015,290(29):17879-17893.

[7]Cook J R.Langlet F,Kido Y,et al.Pathogenesisofselectiveinsulinresistanceinisolatedhepatocytes[J].J Biol Chem,2015,290(22):13972-13980.

[8]张丁丁,辛永宁,罗兵,等.一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法[J].青岛大学医学院学报,2014,50(1):34-36.

[9]王琳,徐建波,田元,等.一种分离新生小鼠肝细胞的简单方法[J].中国优生与遗传杂志,2007,15(1):10-12.

[10]Bangs，Fiona K,Schrode,et al.Lineagespecificityofprimaryciliainthemouseembryo[J].Nat Cell Biol，2015,17(2):113-122.

Simple Separation Method for Mouse Primary Hepatocyte

ZHOUPing,FANJing，LIANGWei

(Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, Chengdu University， Chengdu 610052, China)

The paper studies how to improve the separation method for mouse primary hepatocyte in order to obtain the mouse primary hepatocyte in the most simple and economic way.Retrograde infusion is done by using infusion needles through the inferior vena cava.Then,the needles are fixed by long strip paperboard.In this way,stable suspension of mouse primary hepatocyte can be obtained.As a result,the success rate of the improved retrograde infusion is extremely high and the repetition is also excellent.The hepatocyte needed for experirnents can be obtained.The rate of trypan blue stain-resistance is more than 90%.This method is simple in operation,low in cost and high in efficiency.

perfusion;mouse primary hepatocyte;collagenase Ⅳ

1004-5422(2016)04-0328-03

2016-09-26.

周 萍(1990 — )， 女， 硕士研究生， 从事细胞分离与病理学研究.

R965.2；R329.2

A