Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

2016-03-07霍占江李伟高飞

海南医学 2016年11期

霍占江，李伟，高飞

（1.张家口市第一医院耳鼻咽喉头颈外科，河北张家口 075061；2中国人民解放军第251医院病理科，河北张家口 075000；3.中国人民解放军第251医院重症医学科，河北张家口 075000）

霍占江1，李伟2，高飞3

目的探讨Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌组织中的表达及临床意义。方法收集2005年1月至2010年12月期间在张家口市第一人民医院和中国人民解放军251医院耳鼻喉科住院患者70例，手术病理活检均明确诊断为鼻咽癌。应用免疫组织化学(EnVisionTM)法分别检测Wee1、Noxa蛋白在70例鼻咽癌组织和30例正常组织中的表达，R×C列表卡方法分析其表达与临床病理因素的关系，同时Spearman法分析两蛋白之间的相关性。结果Wee1蛋白在鼻咽癌组织、正常组织中的阳性表达率分别为52.86%(37/70)、10.00%(3/30)，两组比较差异有显著统计学意义(χ2=16.07，P＜0.01)；Noxa蛋白在鼻咽癌组织、正常组织中的阳性表达率分别为38.57%、63.33%，两组比较差异有统计学意义（χ2=5.18，P＜0.05）；Wee1、Noxa蛋白的表达均与肿瘤直径、淋巴结转移、浸润邻近组织及EBV感染有关(P＜0.05)，与性别、年龄、组织学类型及肿瘤部位无关(P＞0.05)。Wee1蛋白与Noxa蛋白在鼻咽癌组织中的表达呈负相关(r=-0.72，P＜0.01)。结论Wee1蛋白的高表达和Noxa蛋白低表达参与了鼻咽癌的发生，两者的异常表达补充了鼻咽癌发生的相关机制。

鼻咽癌；Wee1；Noxa

鼻咽癌是鼻咽部最常见的恶性上皮源性肿瘤，其发病病因还未完全阐明，但认为其与EB病毒感染、化学致癌物质及遗传因素等有关。EB病毒主要感染人类口咽部上皮细胞，体外可诱导人胚鼻咽上皮细胞形态发生部分转化，生长速度加快[1]。细胞的生长受细胞周期及其他因素的调控，而Wee1蛋白在细胞周期转变中具有重要的调节作用，其功能的异常影响细胞的增殖或凋亡。不仅如此，Noxa蛋白作为细胞凋亡的调节因子，其在维持细胞正常功能方面具有重要作用。目前，有关Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌组织中的相关研究未见报道，本实验主要探讨Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌形成中的作用及其与临床病理参数之间的关系，并进一步分析两者蛋白之间可能存在的联系。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2005年1月至2010年12月期间在张家口市第一人民医院和中国人民解放军第251医院住院患者资料70例，手术病理活检明确诊断为鼻咽癌；男性37例，女性33例；患者年龄18～83岁，中位数年龄46岁，其中≥46岁者41例，＜46岁者29例；肿瘤直径≥3 cm者39例，＜3 cm者31例；肿瘤部位：侧壁25例，咽隐窝34例，上侧壁11例；组织学类型：角化性鳞状细胞癌9例，非角化性分化型癌32例，非角化性未分化型癌29例；淋巴结转移者40例，无淋巴结转移者30例；浸润邻近组织者38例，无浸润邻近组织者32例；EBV阳性者36例，EBV阴性者34例。同时选取癌旁正常组织30例作为对照组。

1.2 试剂和方法即用型兔抗人Wee1单克隆抗体及其配套试剂盒、DAB显色剂均由福州迈新生物技术有限公司提供。浓缩型鼠抗人单克隆抗体Noxa及其配套试剂盒、DAB显色剂由武汉博士德生物技术有限公司提供，抗体工作浓度按1:200稀释。免疫组化染色均采用EnVision两步法，操作步骤参照各自试剂盒说明书。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断 Wee1着色于细胞核或细胞质，可表现为浅黄色、棕黄色、棕褐色。计数高倍镜视野下每张切片着色的细胞，判断标准参考文献[2]。染色结果由两名以上病理医师进行双盲评估，并建议-和+标为低表达，记为阴性；++和+++标为高表达，记为阳性。Noxa蛋白阳性着色于细胞质，可表现为浅黄色、黄色、棕黄色。判断标准[3]：计数10个高倍视野下阳性着色细胞所占百分比：阳性细胞≤5%为阴性，＞5%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～75%为3分，＞75%为4分；染色强度：0分为无色，1分为浅黄色，2分为黄色，3分为棕黄色。上述两项相乘1～4分(+)，5～8分(++)，9～12分(+++)。染色结果由两名以上病理医师进行双盲评估，并规定总分≤4分均记为阴性，＞4分均记为阳性。

1.4 统计学方法采用统计分析软件SPSS17.0处理相关数据，计数资料采用χ2检验，多个率之间的比较采用R×C χ2检验，相关性检验采用Spearman法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Wee1、Noxa蛋白在鼻咽癌组织和正常黏膜组织中的表达 Wee1蛋白着色于细胞核，在70例鼻咽癌组织中阳性表达37例，阳性率为52.86%；在30例正常组织中阳性表达3例，阳性率为10.00%，两组比较差异有显著统计学意义(χ2=16.07，P=0.00)；Noxa蛋白着色于细胞质，在70例鼻咽癌组织中阳性表达27例，阳性率为38.57%；在30例正常组织中阳性表达19例，阳性率为63.33%，两组比较差异有统计学意义(χ2= 5.18，P=0.02)，见图1～图4。

图1 Wee1蛋白在鼻咽癌组织阳性表达(EnVision×100)

图2 Wee1蛋白在黏膜慢性炎组织中阴性表达(EnVision×100)

图3 Noxa蛋白在鼻咽癌组织阴性表达(EnVision×100)

图4 Noxa蛋白在正常黏膜组织中阳性表达(EnVision×100)

2.2 Wee1、Noxa蛋白的表达与鼻咽癌临床病理因素的关系 Wee1、Noxa蛋白的表达均与肿瘤直径、淋巴结转移、浸润邻近组织及EBV感染有关(P＜0.05)，而与患者性别、年龄、组织学类型及肿瘤部位无关(P＞0.05)，见表1。

2.3 鼻咽癌组织中Wee1、Noxa蛋白表达的相关性 70例鼻咽癌组织中，Wee1蛋白阳性表达且Noxa蛋白也阳性表达为2例，Wee1蛋白阴性表达且Noxa蛋白也阴性表达为8例；Wee1阳性表达而Noxa阴性表达为35例，Wee1阴性表达而Noxa阳性表达为25例。数据经分析显示，Wee1、Noxa蛋白表达之间呈负相关关系(r=-0.72，P=0.00)，见表2。

表2 Wee1、Noxa蛋白的表达与鼻咽癌临床病理因素的关系

表3 鼻咽癌组织中Wee1、Noxa蛋白表达的相关性

3 讨论

人Wee1基因位于11p15.3～11p15.1，编码分子量为94 kD、含有647个氨基酸的蛋白。Wee1蛋白激酶作为G2/M期检查点的关键激酶而特异性地参与细胞周期的调节，其表达的异常都会影响细胞周期的正常转变，进而改变细胞的生物功能。Pappano等[4]认为，Wee1在正常细胞生长情况下起着肿瘤抑制基因的作用，但在肿瘤细胞系中发现，特异性抑制Wee1不利于无p53活性的肿瘤增殖和生存。吕慧等[5]发现，Wee1蛋白在肝细胞癌中的表达明显高于肝硬化及正常肝组织，不仅如此，肝细胞癌中Wee1蛋白表达越高，其分化程度越低。本实验结果显示，Wee1蛋白在鼻咽癌组织中的表达明显高于正常组织，且其表达与鼻咽癌肿瘤直径、淋巴结转移、浸润邻近组织及EBV感染有关。这说明癌细胞异常高表达Wee1蛋白不仅增加了癌细胞的增殖抗凋亡能力，而且也有利于癌细胞的浸润转移。同时，与EBV感染之间的关系也显示出，EBV感染阳性组中的Wee1蛋白表达明显高于对应组，这提示EBV有可能上调了Wee1蛋白，进而促进了病变的发生。

Noxa是Bcl-2家族成员之一，其含有1个BH3结构域，通过此结构域活化线粒体途径进而促进细胞的凋亡。董伟等[3]研究发现，Noxa蛋白在胃癌组织中的表达明显低于癌旁组织，其表达与胃癌组织分化程度、临床分期、淋巴结转移和远处转移有关，且Noxa蛋白表达阴性的胃癌细胞凋亡指数明显低于表达阳性者。可见，Noxa蛋白在胃癌组织存在异常表达，其表达水平不利于胃癌的发生、发展。谢奇朋等[6]通过依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡的实验发现，胃腺癌细胞中Noxa表达明显上调，其表达在4 h即开始明显增加，8 h达到高峰，48 h胃腺癌细胞凋亡达50%，这提示依托泊苷诱导胃腺癌细胞发生的凋亡与Noxa表达上调有关。也有研究显示，转染Noxa基因的乳腺癌MCF-7细胞增殖抑制和凋亡明显高于对照组，同时细胞DNA合成受到抑制，细胞周期阻滞在G0/G1期[7]。本实验结果显示，Noxa蛋白在鼻咽癌组织中的表达明显低于正常组织，且其表达与鼻咽癌肿瘤直径、淋巴结转移、浸润邻近组织及EBV感染有关。这说明癌细胞异常低表达Noxa蛋白增加了癌细胞的抗凋亡能力，也有利于癌细胞的浸润转移，并且，EBV感染阳性组中的Noxa蛋白表达明显低于对应组，这提示EBV有可能下调了Noxa蛋白，促进了癌细胞的凋亡，进而抑制了癌细胞的增殖。

尽管Wee1和Noxa蛋白均与肿瘤直径、淋巴结转移、浸润邻近组织及EBV感染有关，但两者的表达水平却相反，统计结果显示，鼻咽癌组织中Wee1和Noxa蛋白表达呈现负相关。同时，EBV感染阳性组癌细胞高表达Wee1蛋白及低表达Noxa蛋白，这说明EBV可诱导上调Wee1蛋白表达及下调Noxa蛋白表达，然而它们之间的信号调节机制有待进一步研究。

[1]杨静,唐发清,顾焕华,等.EB病毒介入鼻咽上皮细胞永生化早期阶段的生物学观察[J].实验生物学报,2001,34(2):89-99.

[2]Magnussen GL,Hellesylt E,Nesland JM,et al.High expression of wee1 is associated with malignancy in vulvar squamous cell carcinoma patients[J].BMC Cancer,2013,13(288):1-9.

[3]董伟,魏志,孙自勤,等.凋亡蛋白Bad与Noxa在胃癌中表达及其与细胞凋亡的关系[J].中华实用诊断与治疗杂志,2014,28(7):636-640.

[4]Pappano WN,Zhang Q,Tucker LA,et al.Genetic inhibition of the atypical kinase Wee1 selectively drives apoptosis of p53 inactive tumor cells[J].BMC Cancer,2014,14(430):1-11.

[5]吕慧,杨玉秀,张立达,等.Wee1与肝癌的关系[J].世界华人消化杂志,2011,19(14):1515-1519.

[6]谢奇朋,叶艳,郝延璋,等.bcl-2家族BH3-only蛋白在依托泊苷诱导胃腺癌细胞凋亡中的作用[J].肿瘤防治研究,2006,33(7): 502-505.

[7]赵志,吴爱国,沈三弟.Noxa基因转染乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制和促凋亡作用[J].肿瘤防治研究,2010,37(10):1104-1108.

Expression of Wee1 and Noxa protein in nasopharyngeal carcinoma and its clinical significance.

HUO Zhan-jiang1,LI Wei2,GAO Fei3.1.Department of Otolaryngology,Head and Neck Surgery,the First People's Hospital of Zhangjiakou City, Zhangjiakou 075061,Hebei,CHINA;2.Department of Pathology,the 251thHospital of PLA,Zhangjiakou 075000,Hebei, CHINA;3.Department of Intensive Care Unit,the 251thHospital of PLA,Zhangjiakou 075000,Hebei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of Wee1 and Noxa protein in nasopharyngeal carcinoma and its clinical significance.MethodsA total of 70 cases of nasopharyngeal carcinoma,who were definitely diagnosed as nasopharyngeal carcinoma by surgery pathology biopsy in the First People's Hospital of Zhangjiakou City and the 251thHospital of PLA from January 2005 to December 2010,were selected as the subjects.Expressions of Wee1 and Noxa protein were detected by immunohistochemistry(EnvisionTM)in 70 cases of nasopharyngeal carcinoma and 30 cases of normal tissue.The relationship between expressions of Wee1 and Noxa protein and clinical factor was analyzed by RxC χ2test,and the correlation between Wee1 and Noxa protein was analyzed by Spearman's rank correlation.ResultsThe positive expressions rate of Wee1 protein in nasopharyngeal carcinoma tissues[52.86%(37/70)] was significantly higher than that in normal tissues[10.00%(3/30)],χ2=16.07,P＜0.01,while the positive expression rate of Noxa protein in nasopharyngeal carcinoma tissues[38.57%(27/70)]was significantly lower than that in normal tissues[63.33%(19/30)],χ2=5.18,P＜0.05.The expressions of Wee1 protein and Noxa protein in nasopharyngeal carcinoma tissues were related to tumor size,lymph node metastasis,infiltrating adjacent tissues and EBV infection(P＜0.05),but not related to gender,age,histological category and tumor site(P＞0.05).The expression of Wee1 protein in nasopharyngeal carcinoma tissue was negative correlation with the expression of Noxa protein(r=-0.72,P＜0.01).ConclusionThe overexpression of Wee1 protein and low expression of Noxa protein take part in the development of nasopharyngeal carcinoma,and their abnormal expression may be supplements for the mechanism of nasopharyngeal carcinoma.

Nasopharyngeal carcinoma;Wee1;Noxa

R739.63

1003—6350（2016）11—1776—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.018

2015-12-12)

李伟。E-mail：liwei-324@163.com