青蒿素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其作用机制探讨

马瑞松，江洪，李元红，胡笑容，刘自强

(1.武汉大学人民医院心内科，湖北 武汉 430060；2.恩施土家族苗族自治州中心医院心内科，湖北 恩施 445000)

青蒿素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其作用机制探讨

马瑞松1，江洪1，李元红2，胡笑容1，刘自强1

(1.武汉大学人民医院心内科，湖北 武汉 430060；2.恩施土家族苗族自治州中心医院心内科，湖北 恩施 445000)

目的 探讨青蒿素对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响及其可能作用机制。方法采用大鼠心肌缺血再灌注模型(缺血30 min，再灌注4 h)，雄性SD大鼠30只根据随机数字表随机分为三组：假手术组(SO组，n=10)、缺血再灌注组(I/R组，n=10)和青蒿素治疗组(A+I/R组，n=10，Artemisinin：25 mg/kg，Tid，造模前1 d灌胃)。检测心肌损伤标记物肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌钙蛋白I(cTnI)；检测炎症因子高迁移率族蛋白1(HMGB1)、白介素17A(IL-17A)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INF-γ)和白介素6(IL-6)；检测总p38(t-p38)和磷酸化p38(p-p38)。结果与SO组比较，I/R组中心肌损伤标记物CK[(3 891±245.44)U/L vs(1 539±140.57)U/L]、LDH [(1 917±140.54)U/L vs(889±87.23)U/L]、cTnI[(66.34±2.13)pg/mL vs(26.45±1.72)pg/mL]；炎症因子HMGB1 [(0.423±0.059)vs(0.301±0.067)]、IL-17A[(149.29±5.88)pg/mL vs(55.26±4.33)pg/mL]、TNF-α[(185.27±5.61)pg/mL vs(95.34±3.56)pg/mL]、INF-γ[(418.86±12.37)pg/mL vs(223.35±10.51)pg/mL]、IL-6[(156.89±6.01)pg/mL vs (65.43±4.21 pg/mL]、p-p38[(0.416±0.025)vs(0.188±0.013)]表达明显增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与I/R比较，A+I/R组中心肌损伤标记物CK[(1934±199.56)U/L]、LDH[(973±79.47)U/L]、cTnI[(38.1±2.69)pg/mL]和炎症因子HMGB1(0.174±0.026)、IL-17A[(93.65±2.69)pg/mL]、TNF-α[(145.85±3.92)pg/mL]、INF-γ[326.54±9.81]pg/mL]、IL-6[(95.47±3.16)pg/mL]、p-p38[(0.297±0.021)]表达明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论青蒿素可能通过抑制p38MAPK通路减轻I/R中炎症反应；青蒿素亦可通过抑制炎症反应减轻心肌缺血再灌注损伤。

青蒿素；炎症；p38MAPK；心肌缺血再灌注损伤

急性心肌梗死是威胁我国人民健康的首要因素之一，早期再灌注治疗溶栓和急诊经皮冠脉介入治疗(PCI)可以最大程度地减轻心肌梗死的危害，改善人民的生存质量。组织缺血一段时间后再灌的同时也可以加重心肌组织的损伤，如凋亡和坏死，这种现象称为心肌缺血再灌注(I/R)损伤。缺血再灌注损伤是限制早期再灌注治疗获得最佳疗效的首要因素，因此，如何减轻心肌I/R损伤从而最大程度改善患者生存质量也是临床的重要任务之一。

青蒿素是青蒿的活性成分，且在世界范围内被证实为100%有效的抗疟药[1]。前期研究证实，青蒿素除抗疟作用外还可显著减少心肌I/R损伤，主要作用机制可能与抗氧化以及清除氧自由基有关[2]。大量实验证实，青蒿素具有明显的抗炎作用[3-5]。但青蒿素是否可以通过抑制炎症反应减弱心肌I/R损伤仍无相关研究。为了验证这个假设，我们在2015年11月至2016年1月进行了如下研究：

1 材料与方法

1.1 动物准备与分组 30只成年雄性SD大鼠，购于武汉大学动物实验中心。于恒温、恒湿、明/暗交替(12 h)的环境喂养48 h。大鼠缺血再灌注模型：2%戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg，ip)后，仰卧固定于鼠板，气管插管(频率70次/min，吸呼比1:1.5，潮气量3～4 mL/100 g)。胸骨左缘切口，暴露心脏，破心包膜；于左心耳下2～3 mm处将前降支与一个中间带有凹槽的空心乳胶管一起结扎。结扎线下心肌变苍白表明缺血成功。缺血30 min后，沿乳胶管凹槽剪断结扎线再灌注4 h。再灌注4 h，2%戊巴比妥钠麻醉(20 mg/kg，ip)，颈静脉采血2 mL，迅速剪下心脏，剪除多余部分留取心梗区(白色)和缺血区(白色附近5 mm)用于检测。30只大鼠随机分为三组：假手术组(SO，n=10)：仅插管、开胸、LAD下穿线但不结扎；缺血再灌注组(I/R，n=10)：按照上面所述造模，缺血30 min，再灌注4 h；青蒿素治疗组(A+I/R，n=10)：造模前1 d青蒿素灌胃(25 mg/kg。Tid)，造模同I/R组。

1.2 检测指标和方法

1.2.1 分光光度法检测血清乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)和肌钙蛋白I(cTnI) 静脉采血后静置10 min，待血液凝固后离心(3 000 r/min×15 min)，取血清。选用南京建成生物工程研究所试剂盒，严格按照说明操作检测LDH和CK。

1.2.2 ELISA法检测心肌组织炎症因子 制备心肌组织匀浆，选用南京建成生物工程研究所试剂盒，严格按照说明操作检测心肌组织中白介素17A(IL-17A)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(INF-γ)和白介素6 (IL-6)。根据标准曲线算出各因子浓度(pg/mL)。

1.2.3 Western blot法检测HMGB1、总P38(t-p38)和磷酸化p38(p-p38)方法如前所述[6]，简言之，12% PAGE胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，HMGB1、anti-p38和anti-p-p38的一抗液体中孵育过夜，在相应的二抗中孵育，ECL显色。以β-actin为参照计算HMGB1、t-p38和p-p38的相对表达量。

1.3 统计学方法 应用SPSS21.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组大鼠的心肌损伤标记物比较 与SO组比较，I/R组中心肌损伤标记物(LDH，CK和cTnI)水平均明显升高(P＜0.05)；A+I/R组中CK和cTnI水平明显升高(P＜0.05)，但LDH水平与SO组相近，差异无统计学意义(P＞0.05)。与I/R组比较，A+I/R组中LDH、CK和cTnI水平明显降低(P＜0.05)，见表1。

表1 三组大鼠的心肌损伤标记物比较(±s)

表1 三组大鼠的心肌损伤标记物比较(±s)

注：与SO组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05。

组别LDH(U/L)CK(U/L)cTnI(pg/mL) SO组I/R组A+I/R组F值P值889±87.23 1917±140.54a973±79.47b 175.7＜0.01 1539±140.57 3891±245.44a1934±199.56ab478.3＜0.01 26.45±1.72 66.34±2.13a38.1±2.69ab1858＜0.01

2.2 三组大鼠的心肌组织中炎症因子表达比较 与SO组比较，I/R组和A+I/R组中炎症因子(HMGB1、IL-17A、TNF-α、INF-γ和IL-6)表达均明显升高(P＜0.05)。与I/R组比较，A+I/R组中炎症因子(HMGB1、IL-17A、TNF-α、INF-γ和IL-6)的表达均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 三组大鼠的心肌组织中炎症因子表达比较(±s)

表2 三组大鼠的心肌组织中炎症因子表达比较(±s)

组别SO组I/R组A+I/R组F值P值HMGB1/β-actin 0.301±0.067 0.423±0.059a0.174±0.026ab51.59＜0.01 IL-17A(pg/mL) 55.26±4.33 149.29±5.88a93.65±2.69ab404＜0.01 TNF-α(pg/mL) 95.34±3.56 185.27±5.61a145.85±3.92ab479＜0.01 INF-γ(pg/mL) 223.35±10.51 418.86±12.37a326.54±9.81ab801＜0.01 IL-6(pg/mL) 65.43±4.21 156.89±6.01a95.47±3.16ab307＜0.01

2.3 三组大鼠的p38-MAPK通路比较 与SO组比较，I/R组中p-p38表达水平明显升高(P＜0.05)，但t-p38表达水平相近，差异无统计学意义(P＞0.05)。与I/R组比较，A+I/R组中p-p38水平明显降低(P＜0.05)，但t-p38表达水平相近，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 三组大鼠的p38-MAPK通路比较(±s)

表3 三组大鼠的p38-MAPK通路比较(±s)

注：与SO组比较，aP＜0.05；与I/R组比较，bP＜0.05。

组别SO组I/R组A+I/R组p-p38/β-actin 0.188±0.013 0.416±0.025a0.297±0.021abt-p38/β-actin 0.624±0.037 0.636±0.040 0.628±0.041 F值P值39.87＜0.01 0.22 0.80

3 讨 论

青蒿素是由我国专家最先从青蒿中提取的活性成分，因其100%的抗疟性而受到世界的关注[1]。近年的研究发现[3-5]，青蒿素可以通过代谢为二氢青蒿素发挥显著的抗炎作用。在风湿性和类风湿性疾病中，青蒿素不但可以调节体液免疫还可以调节细胞免疫，显著抑制IL-1和IL-6等炎症因子的表达，进而抑制炎症反应[7]。进一步的研究发现，青蒿素可以调节T调节细胞(Treg)的表达，Treg细胞可以直接作用于未分化的CD4+T细胞或通过分泌转化生长因子(TGFβ)等细胞因子作用于未分化的CD4+T细胞，抑制Th17细胞的分化，Th17细胞是近年新发现的不同于Th1和Th2的辅助型细胞亚群，主要分泌IL-17A。故青蒿素可以通过抑制IL-17A表达，抑制炎症反应。在心脏方面，Gu等[3，8]发现青蒿素可以通过减弱心梗后炎症反应(TNF-α、IL-1β表达)抑制心梗后交感神经重构，以及恶性心律失常的发生，且可能与核因子kappaB (NF-kappaB)通路相关。本研究发现，青蒿素可以显著抑制缺血再灌注诱导的心肌酶和炎症因子HMGB1、IL-17A、TNF-α、INF-γ和IL-6的表达，有明显的抗炎和心肌保护作用。

HMGB1、IL-17A、TNF-α、INF-γ和IL-6均是心肌缺血再灌注损伤中典型的炎症因子[9]，其表达水平反映了缺血再灌注损伤的炎症水平。HMGB1是近年新发现的促炎因子，在心肌缺血再灌注损伤中发挥了重要作用[10-11]。HMGB1存在于细胞核内，当细胞坏死时被释放到细胞外，可作为一种独立炎症因子，加重局部的炎症反应，同时还可以通过HMGB1-TLR4-IL-23/IL-17A轴调节下游IL-6和TNF-α的分泌进一步加重炎症反应[12-14]。如上所述，青蒿素还可以作用于幼稚型CD4+T细胞抑制Th17的分化，进而减少IL-17A的产生，减轻心肌缺血再灌注损伤，这也与本研究结果一致。此外，本研究发现，青蒿素可显著抑制I/R中p38MAPK通路激活。P38MAPK通路是一条经典的炎症通路，参与了多种炎症反应，包括心肌I/R损伤[14]。前期的研究证实，抑制p38MAPK通路激活可显著抑制HMGB1等炎症因子的释放[12]。因此，青蒿素可能通过抑制p38MAPK通路，抑制心肌缺血再灌注损伤中炎症反应。

综上所述，青蒿素可能通过抑制p38MAPK通路抑制HMGB1等炎症因子表达，也可通过抑制炎症反应减轻心肌缺血再灌注损伤。

[1]Haynes RK.Artemisinin and derivatives:the future for malaria treatment?[J].Curr Opin Infect Dis,2001,14(6):719-726.

[2]孙丽红,李鸿珠,韩丽萍,等.青篙素对离体大鼠的心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].中国中药杂志,2007,32(15):1547-1551.

[3]Gu YW,Wang X,Wu G,et al.Artemisinin suppresses sympathetic hyperinnervation fowwlowing myocardial infarction via anti-inflammatory effects[J].J Mol Histol,2012,43(6):737-743.

[4]Li T,Chen H,Wei N,et al.Anti-inflammatory and immunomodulatory mechanisms of artemisinin on contact hypersensitivity[J].Int Immunopharmacol,2012,12(1):144-150.

[5]Wang Z,Qiu J,Guo TB,et al.Anti-inflammatory properties and regulatory mechanism of a novel derivative of artemisinin in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Immunol,2007,179(9): 5958-5965.

[6]江洪,马瑞松,李元红,等.白介素33激活P38-MAPK通路保护心肌缺血再灌注损伤[J].实用医学杂志,2015,31(12):1911-1914.

[7]Efferth T,Romero MR,Wolf DG,et al.The antiviral activities of artemisinin and artesunate[J].Clin Infect Dis,2008,47(6):804-811.

[8]Gu YW,Wang X,Wu G,et al.Artemisinin prevents electric remodeling following myocardial infarction possibley by upregulating the expression of connexin 43[J].Mol Med Rep,2014,10(4): 1851-1856.

[9]Zhu H,Li J,Wang S,et al.Hmgb1-TLR4-IL-23-IL-17A axis promote ischemia-reperfusion injury in a cardiac transplantation model [J].Transplantation,2013,95(12):1448-1454.

[10]Hu X,Cui B,Zhou X,et al.Ethyl pyruvate reduces myocardial ischemia and reperfusion injury by inhibiting high mobility group box 1 protein in rats[J].Mol Biol Rep,2012,39(1):227-231.

[11]Andrassy M,Volz HC,Igwe JC,et al.High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart[J].Circulation,2008,117 (25):3216-3226.

[12]Kawahara K,Biswas KK,Unoshima M,et al.C-reactive protein induces high mobility group box-1 protein release through activation of p38MAPK in macrophage RAW264.7 cells[J].Cardiovasc Pathol, 2008,17(3):129-138.

[13]Ding HS,Yang J,Chen P,et al.The HMGB1-TLR4 axis contributes to myocardial ischemia/reperfusion injury via regulation of cardiomyocyte apoptosis[J].Gene,2013(1):527:389-393.

[14]Gao XF,Zhou Y,Wang DY,et al.Urocortin-2 suppression of p38MAPK signaling as an additional mechanism for ischemic cardioprotection[J]. Mol Cell Biochem,2015,398(1-2):135-146.

Effects and mechanism of artemisinin on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.

MA Rui-song1,JIANG Hong1,LI Yuan-hong2,HU Xiao-rong1,LIU Zi-qiang1.1.Department of Cardiology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA;2.Department of Cardiology,the Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture,Enshi 445000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects and possible mechanism of artemisinin on myocardial ischemia reperfusion injury in rats.MethodsRat I/R models were established by ischemia 30 min and reperfusion 4 h. Thirty SD rats were divided into three groups according to the random number table:sham operation group(SO,n=10), ischemia and reperfusion group(I/R,n=10)and artemisinin treatment group(A+I/R,n=10).Cardiac injury markers,including creatine kinase(CK),lactate dehydrogenase(LDH),and cardiac troponin(cTnI)were detected.The inflammatory cytokines[high mobility group box protein 1(HMGB1),interleukin-17A(IL-17A),tumor necrosis factor-α (TNF-α),gamma interferon(INF-γ),interleukin-6(IL-6)],total p38(t-p38),phosphorylation p38(p-p38))were detected.ResultsCompared with SO group,I/R group was significantly higher(P＜0.05)in the cardiac injury markers of CK [(3 891±245.44)U/L vs(1 539±140.57)U/L],LDH[(1 917±140.54)U/L vs(889±87.23)U/L]and cTnI[(66.34±2.13)pg/mL vs(26.45±1.72)pg/mL],the inflammatory cytokines of HMGB1[(0.423±0.059)vs(0.301±0.067)],IL-17A[(149.29± 5.88)pg/mL vs(55.26±4.33)pg/mL],TNF-α[(185.27±5.61)pg/mL vs(95.34±3.56)pg/mL],INF-γ[(418.86±12.37)pg/mL vs(223.35±10.51)pg/mL],IL-6[(156.89±6.01)pg/mL vs(65.43±4.21)pg/mL],and p-p38[(0.416±0.025)vs(0.188± 0.013)].Compared with I/R group,A+I/R group was significantly lower(P＜0.05)in the cardiac injury markers of CK [(1 934±199.56)U/L],LDH[(973±79.47)U/L]and cTnI[(38.1±2.69)pg/mL],inflammatory cytokines of HMGB1 [(0.174±0.026)],IL-17A[(93.65±2.69)pg/mL],TNF-α[(145.85±3.92)pg/mL],INF-γ[(326.54±9.81)pg/mL],IL-6 [(95.47±3.16)pg/mL],and p-p38[(0.297±0.021)].ConclusionArtemisinin can inhibit inflammatory responses probably via suppressing p38 MAPK signaling pathway activation,and thus attenuate myocardial I/R injury.

Artemisinin;Inflammation;p38MAPK;Myocardial ischemia and reperfusion injury

R-332

A

1003—6350（2016）11—1734—03

2016-01-19)

国家自然科学基金（编号：81370308）；湖北省卫计委重点项目（编号：WJ2015MA021）

江洪。E-mail：jianghwurm@163.com；李元红。E-mail：yuanhongwhu@126.com