丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的临床研究

冀敏 郭新菊

丙型肝炎病毒抗体双抗原夹心法的临床研究

冀敏 郭新菊

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)抗体双抗原夹心法的临床作用。方法190份血液筛查阴性标本及190份质控血液标本,应用双抗原夹心法对HCV抗体进行检测,分析其检测效果。结果ChironRIBA确认试剂检测127份HCV抗体阳性标本中通过双抗原夹心法显示阳性126份,1份阴性,敏感性为99.21%。结论HCV抗体双抗原夹心法检测具有较高准确性,敏感性高,值得临床推广应用。

丙型肝炎病毒抗体；双抗原夹心法

HCV是在输血后导致肝炎发生的一个重要因素,往往经血液或血液制品进行传播,经调查发现,HCV感染具有世界性分布特点,为了能够避免HCV通过血液进行扩散,需对每个献血者实施抗-HCV指标检测［1］。通常选取间接酶联免疫法进行检测,此方法操作时包被抗原的组成及质量具有关键作用［2］。目前对抗-HCV间接酶联免疫法试剂进行单独检测时显现阳性,且处于临界值相邻样本,以双抗原夹心酶联免疫法试剂进行检测时则呈现阴性,伴随临床医学发展,双抗原夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)对于HCV血清学诊断具有较为显著的改善作用,效果明显［3］。本文选取190份血液筛查阴性标本,分析双抗原夹心法作用,现报告如下。

1 材料与方法

1.1试验材料 选取本院2012年6月～2014年12月190份血液筛查阴性标本,同时采集190份质控血液标本。

1.2方法 将所选取的380份血液标本进行严格检测,应用双抗原夹心法检测HCV抗体。在检测时所应用试剂有吉比爱、Ortho丙肝病毒抗体酶联免疫诊断试剂,ChironRIBA确认试剂。

1.2.1抗原制备 嵌合表位抗原经包涵体的形式表达,采取离子交换层析措施进行纯化,然后通过SephadexG-50柱凝胶完成过滤采集,应用SDS-PAGE将抗原蛋白进行仔细鉴定。

1.2.2双抗原夹心法 应用50 mmol/L碳酸盐缓冲液对抗原予以稀释处理,多肽抗原具体浓度为：结构处多肽151 g/ml,NS4处多肽0.51 g/ml,NS5处多肽0.251 g/ml,所应用到的基因工程表达抗原具体浓度有c7应用1 g/ml,C11应用1 g/ml。每个孔内均加进100 µl,在37℃状态中持续保存1 h,然后放置到4℃冰箱内过夜,应用30%小牛血清PBST实施封闭处理,在每个孔内加进200 µl,37℃状态中保存1 h,然后去除封闭液,应用50 µl样品稀释液,每个孔内加进5 µl,37℃状态中保存30 min,然后应用PBST进行5次冲洗。选择最为适宜酶稀释度,通过棋盘滴定方法在每个孔内加进50工作浓度的酶标记抗原,37℃条件下放置15 min,经PBST冲洗5次,每孔加入50 µl底物缓冲液及50 µl显色剂,在37℃状态中保存10 min,使之能够完全显色。然后在每个孔内加进50 µl 2 mol/L硫酸,停止反应,应用酶标仪于450 nm波长条件下实施吸光度效果检测,若检测结果≥临界值者则表示阳性,反之则表示阴性。

2 结果

应用双抗原夹心法检测标本,显示126份为阳性标本,1份为阴性标本,应用ChironRIBA确认试剂检测显示其均呈现阳性,双抗原夹心法检测敏感性为99.21%。见表1。

表1 双抗原夹心法检测结果分析(n)

3 讨论

对患者HCV抗体进行检测是确定其是否发生感染的初步阶段,主要有用作筛检工作的酶免疫检测(EIA)以及用作确证工作的重组免疫印迹试验(RIBA),其中RIBA由于需要较高费用且并未建立严格试验标准,目前在临床诊疗中并无较多应用［4］。由于EIA存在较为明显的便利性及稳定性、自动化功能强、价格较低等优点,在临床中应用到血液筛查及检测工作较为广泛。目前EIA发展至第三代,依然实施间接法予以检测,因其方法学存在一定固有缺陷性,极易导致结果出现假阳性及漏检情况［5］。目前在临床中将双抗原夹心ELISA法检测试剂作为发展方向具有较为明显应用价值,夹心法可使得酶标记的特异性抗原将间接法检测时酶标记的抗体进行取代由此完成整个检测,与间接ELISA法进行比较,其对于样品检测存在双特异性选择特点,可以将血清内出现的抗HCV的总抗体完成检测,有效防止间接ELISA法所存在的检测弊端,确保检测结果具有更高的敏感性与特异性,而且因为HCV抗原所具有的分子量较小,以酶进行HCV抗原的直接性标记,往往使得空间位阻情况发生,导致抗体与抗原无法轻易结合,存在较为明显抑制作用,因此HCV抗原的标记是建立抗HCV抗体的双抗原夹心ELISA检测方法的一个较为重要的难点［6］。

在本文研究中,双抗原夹心法检测显示阳性为126份,阴性为1份,双抗原夹心法检测无需对血清产品予以稀释,也不会因类风湿因子等不良因素而受到干扰,存在较为理想的特异性,而且能够对血清中各种抗体予以检测,尤其免疫球蛋白M(IgM)类抗体可以明显减少自病毒感染至应用ELISA法检测到抗体间的“窗口期”。所以采取双抗原夹心ELISA法检测确保HCV感染诊断试剂存在较高特异性,其检出率明显上升,有效缩短检测时间,具有较高临床推广应用价值。

［1］李文新.不同方法试剂检测丙型肝炎病毒抗体结果分析.中国输血杂志,2014,27(6):622-624.

［2］龙宏洋,叶玉芬,朱学强,等.丙型肝炎病原学不同检测方法的临床应用价值对比分析.检验医学与临床,2015,12(5):597-599.

［3］孟庆玲,鲁健,邱丰,等.丙型肝炎IgG抗体ELISA诊断试剂比对分析.中华实验和临床病毒学杂志,2013,27(3):221-223.

［4］鲜玉萍,杨红英.丙型肝炎核心抗原检测的临床意义.检验医学与临床,2012,9(18):2320-2321.

［5］张健,刘宜仲,杨珊,等.HCV核心抗原检测在血液筛查中的初步研究.现代检验医学杂志,2012,27(2):110-111.

［6］赵璐,冯悦,夏雪山.HCV基因型的差异性流行与进化.遗传,2012,34(6):666-672.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.04.013

2015-05-07］

453000 河南省新乡市妇幼保健院检验科