海虾致死试验筛选天然活性成分的研究进展＊

郭晶晶，张 屏，李瑞娟，赵红梅，岳 鑫，包保全＊

（内蒙古医科大学药学院 呼和浩特 010059）

海虾致死试验筛选天然活性成分的研究进展＊

郭晶晶＊＊，张 屏＊＊，李瑞娟，赵红梅，岳 鑫，包保全＊＊＊

（内蒙古医科大学药学院 呼和浩特 010059）

海虾致死试验是近年快速发展起来的一种天然活性成分筛选方法，广泛应用于细胞毒、抗癌和杀病原虫等药理活性的筛选，也是毒性评估的重要工具之一。该方法利用简单的生物有机体——丰年虾（Brine Shrimp，Artemia sp.）的幼虫，体外给予不同浓度的待测样品，培养一定时间后测定海虾幼虫的存活数，计算出LD50值作为活性评价指标。该方法应用整体动物进行体外实验，具有操作简单、快速、经济、结果准确、重复性好等优点。样品用量在20 mg以下，适用于天然提取物的活性筛选和活性追踪分离。

海虾致死性试验 细胞毒 抗癌 杀锥虫

活性成分筛选是指对可能作为药用的物质进行初步的药理活性检测和试验，以发现其药用价值和临床用途为目的，为开发新药提供最初始的依据和资料。药物筛选可在整体动物水平、组织器官水平、细胞和分子水平进行，要求尽可能高效准确。海虾致死试验（Brine Shrimp Lethality Test，BSLT）是一种测定杀死实验室培养的丰年虾（Artemia sp.）幼虫能力的试管实验，由Michael AS等在1956年提出，后来由Vanhaecke P（1981年），Sleet RB 和 Brendel K（1983年）等人开发，最初用于测定真菌毒素、藻类毒素、植物毒素、重金属、杀虫剂和牙科材料的毒性，是初步评估毒性的有效手段[1]。近20年来，该方法在天然物活性成分筛选方向得到了快速发展和应用，所涉及的生物活性包括细胞毒、抗癌和杀原虫等。本文概述了海虾致死试验的原理、实验方法和注意事项，对其在天然活性成分筛选中的应用做了初步分类和统计，总结了该法的特点和优势，为从事天然活性成分筛选和活性成分追踪分离的科研工作者提供参考。

1 海虾致死试验方法与注意事项

1.1 海虾致死试验的原理

海虾致死试验是利用海虾幼虫（Brine shrimp nauplii）对有毒物质敏感而进行的药理毒性试验。试验中采用丰年虾（Artemia sp.）的休眠卵，在一定浓度的盐水中脱水而启动生命周期，孵化出海虾幼虫。海虾幼虫以滤食海水中的有机物为生，对有毒物质敏感，食入具有细胞毒、抗癌、抗菌、杀虫等活性的物质均可致其死亡。因此，可以通过计算半数致死剂量LD50值，来估计待测物的毒性[2]，LD50＞ 1 000 μg·mL-1无毒，500＜LC50＜1 000低毒，LC50＜500有毒。

1.2 仪器、试剂与材料

海虾卵（Artemia sp.）：各厂牌海虾卵都是在自然界中直接采集而得的，由于各产地的品种并不一样，因此在孵化率及孵化时间上会有差异存在。中国品种为丰年虾（Artenmia sinica），孵化时间大约17 h。

人工海水：实验中为了保证均一性，所用海水均为人工配制而成，方法为海盐或NaCl溶于去离子水中，浓度一般控制在35 g·L-1。

待测样品：本实验中待测物通常为粗提物或经过初步分离的组分，通常配制成10、100和1 000 μg·mL-1三个浓度，溶解或混悬分散于人工海水中。

海虾孵化器：多为实验室自制，选一左右结构的不透明容器，在两室的中间挡板底部打一排小孔（直径1-2 mm），一室上加不透明盖作为孵化室，另一室暴露于光照中作为收集室。

此外，还需要恒温水浴锅、台灯、10 mL玻璃试管等。

1.3 实验方法

海虾幼虫卵的孵化：将装有人工海水的海虾孵化器放入恒温水浴锅中，在25-29 ℃稳定温度下孵化。在孵化室中加入丰年虾休眠卵，孵化室加盖，同时打开台灯照射收集室。由于趋光性，孵化出的健康海虾幼虫自孵化器底部的小孔游出。收集海虾幼虫，禁食培养24 h后，选取游动性好的幼虫进行试验。

分组与给药：试验分为4组，空白和待测样品（浓度分别为10、100、1 000 μg·mL-1），每组设3个平行样，在10 mL试管中进行，每管加入5 mL待测样品溶液，空白加入5 mL人工海水。用吸管将海虾幼虫转移到试管中，每管10只，在光照和恒温水浴条件下继续培养24 h。

测定与结果处理：将试管中的人工海水连同海虾倒入培养皿，在光照下准确数出每管中死亡幼虫（无运动）的只数，计算百分死亡率。采用加权概率单位法（Bliss法），用Finney computer程序在计算机上运算，得出半数致死剂量LD50和95%的置信区间。

1.4 注意事项

空白组海虾幼虫的死亡：试验中出现空白组幼虫死亡现象，应注意幼虫开始孵化到试验结束不得超过72 h，否则会因饥饿致死；人工海水应用去离子水配制，蒸馏水含氧量少导致幼虫死亡；配制人工海水的海盐应选择正规厂家产品，如Sigma Sea Salt，因为中国近海域海盐因受污染而有幼虫致死活性；保证温度控制在25 °C以上，过低导致死亡。

高浓度样品不溶：海虾是滤食动物，对大小5-16 μm的颗粒有较高的摄食率。一些海水中溶解度不好的待测物，可以先加入DMSO溶解，再配成人工海水的混悬液，DMSO用量不得超过1%，并以相同浓度DMSO的人工海水作空白对照。

2 海虾致死试验在天然活性成分筛选中的应用

海虾致死试验建立在海虾对有毒物质敏感的基础之上，最初用于检测杀虫剂的残留物、霉菌毒素等有毒物质。1982年，美国普渡大学药学院Mclaughlin JL教授[3]研究发现，天然产物的海虾致死率与对癌细胞的抑制率之间具有正相关性，可用于抗癌活性初步测定。之后，该试验方法逐渐发展成为一种常用的细胞毒性、抗癌及杀病原虫活性筛选方法，应用天然产物活性筛选和活性追踪分离研究。该方法在国内的应用始于1994年，阎宝琦等[2]首次报道了该法在地衣提取物抗癌活性筛选研究中的应用。迄今为止，国内已有64篇研究论文报道，大部分集中于近五年发表，主要应用于细胞毒性[4-17]、抗癌[18-23]活性筛选方法（表1）。

表1 国内海虾致死试验在天然活性成分研究中的应用报道情况

2.1 海虾致死试验用于细胞毒活性筛选

海虾致死试验建立之初主要用于检测食物或医疗用品的毒性，如重金属、杀虫剂残留物和牙科材料的毒性检查等。后来，随着人们对细胞毒活性认识的加深，逐步开始对一些有毒物质，如真菌毒素、藻类毒素、低等海洋动物毒素以及植物毒素等进行提取、分离和纯化，以期发现具有抗癌、抗菌、杀病原虫等活性的药物。在此过程中，海虾致死试验已逐步发展成为一种成熟的细胞毒活性筛选和活性追踪分离方法。2012年，印度学者Patel S等[24]采用海虾致死试验对爵床属植物Justicia gendarussa进行活性追踪分离，发现其叶和根的甲醇提取物显示有很强的细胞毒活性LD50 分别为48.71 μg·mL-1和93.25 μg·mL-1，进一步分离并从中得到两个纯品化合物，细胞毒活性LD50 分别为8.13 μg·mL-1和15.41 μg·mL-1，可作为合成抗癌药物的先导化合物。2008年，中国海洋大学刘培培等[25]为从极端环境微生物中获得抗肿瘤药物的先导化合物，采集内蒙古盐湖沉积物并从中分离了96株耐盐真菌，通过海虾生物致死活性法筛选，获得了1株具有较强活性的耐盐真菌Aspergillus variecolor B-17，采用活性追踪分离方法，从该菌株的发酵产物的石油醚层提取物中分离得到了3个具有细胞毒活性的单体化合物。2009年，Shagufta H等[26]人为从植物共生菌中寻找具有抗菌、抗癌的药物，从不同农作物的种子中分离得到8株镰刀菌（Fusarium solani），对其培养液进行海虾致死试验，从中分离得到5株较高毒性的菌株，从中分离得到的化合物可开发为毒性化合物使用。

2.2 海虾致死试验用于抗癌活性筛选

1982年，Mclaughlin JL教授试验证明，海虾致死率与人鼻咽癌细胞（9KB）的抑制率之间呈正相关性，推荐海虾致死试验作为一种试验室常规的抗癌活性筛选工具使用[3]。1991年，美国国立肿瘤研究所的Suffness MA博士采用已知的抗肿瘤药物（体内抗P388肿瘤），用双盲法对不同的抗癌活性筛选法的准确度进行比较，包括土豆碟法、海虾致死法和3种人体实体瘤（肺癌A-549，乳腺癌MCF-7，结肠癌HT-29）细胞毒性法，结果证明海虾致死试验比3种人体实体瘤细胞毒性法更准确[19]。由此，海虾致死试验被广泛地应用于合成药物、微生物、低等生物、海洋低等动物及高等植物抗癌活性筛选和活性追踪分离研究。朱天娇等[20]采用海虾致死试验对259株极地微生物进行了抗肿瘤活性筛选，从中选出具有显著抗肿瘤活性的细菌20株、真菌3株和放线菌6株，活性筛出率达到11%，显示出极地微生物在活性物质研究方面具有良好的应用潜力。方玉春等[21]对青岛沿海海洋附着生物资源进行调查，采用海虾细胞毒性法对已鉴定的18种附着生物进行抗肿瘤活性筛选，从中发现了5种具有抗肿瘤活性的附着生物，包括美洲海鞘、大菊海鞘、山形海绵红藻、海黍子及山形海绵，并对其活性部位追踪分离，为进一步寻找抗肿瘤活性先导化合物进行了初步探索。陈学敏等[22]设计出一种合成噢哜的简便方法并合成了4种不同的化合物，当对产物进行海虾幼虫致死性生物测定时发现6-羟基噢哜有很强的抗癌活性。付明海等[23]对内蒙古阿拉善地区芹叶铁线莲提取分离出来的24个样品作了抗癌活性的初步筛选，得到了具有抗肿瘤活性的有效部位。

2.3 海虾致死试验用于杀原虫活性筛选

锥虫病是一种流行于热带地区的疾病，几乎没有适当的药物可以用于治疗该疾病，从而加剧了锥虫耐药性的发展。2001年，Olila D等[27]采用海虾致死试验追踪分离法对乌干达药用植物Warburgia ugandensis进行化学成分研究，从中分离得到了一个倍半萜类化合物Muzigadial，具有很好的抗锥虫耐药株IL 3338和IL1180的活性，可作为杀锥虫先导药物开发，同时提出海虾致死试验很可能成为一种有效的杀锥虫活性筛选法。

3 海虾致死试验特点和优势

海虾致死性试验作为一种活性筛选和活性追踪分离方法，广泛应用于天然产物活性研究，旨在从中筛选结构新颖且具有生物活性的新药和先导化合物。该方法已成为现如今科学家们最信赖的试验方法之一，具有的诸多特点和优势。

首先，海虾幼虫卵孵化及获得条件的简便快速，海虾幼虫卵在干燥状态下可存活数年，用时在室温将其置于海水中数小时内即可孵化成许多幼虫,这样供药物筛选的动物材料来源简便快捷，无需无菌操作，成本极低，且其样品消耗量在20 mg以下。可见该方法是一种快捷、方便、可以在化学实验室进行的方法，适用于天然产物活性筛选和活性追踪分离。

其次，海虾致死试验较容易地应用了较多数目的生物个体，便于进行大量生物学统计，所得结果受动物个体差异影响较小。本实验无需无菌操作，试验条件极易控制，其结果海虾死亡率可准确统计。以上特点保证了该方法的准确性，是其在微观尺度上分析细胞毒性的突出优点[28]。

最后，海虾致死试验不仅可以对多种不同生物活性进行有效的、低成本的筛选，是一种快速的广谱的活性筛选方法,而且其研究对象范围极广，可用于微生物、低等生物、海洋低等动物，也可以用于指导高等植物活性成分的筛选和分离、检测。

4 结论与展望

海虾致死试验活性筛选和活性追踪分离方法的建立和发展，是近20年来天然活性成分研究中的一个重要内容。它建立在海虾幼虫对有毒物质敏感的基础之上，测试有毒物质对海虾的致死能力，与细胞毒性呈正相关性，并具有广谱细胞毒的特点，可用于细胞毒、抗癌、杀原虫等活性的初筛和活性追踪分离。该方法具有操作简单、快速、经济、结果准确、重复性好和样品用量少等优点，适合在化学实验室推广应用。

海虾致死性试验也存在一些不足之处。第一，以致死率为单一判断指标，试验过程中海虾幼虫游动性减少且尚未死亡的现象无法列入统计计算死亡率；第二，所需样品量在20 mg范围内，远超体外细胞实验，因此在天然产物研究中主要用于粗组分的活性测定和活性追踪分离；第三，不能用于抗肿瘤机理研究。近年来，出现了一些海虾致死试验与其它生物模型联用方法，如海虾致死试验与流式细胞术的分级组合筛选[29],多种活性模型（抗菌、海虾致死、细胞毒、抗癌）组合筛选[30，31]，生物活性与HPLC-PAD化学组合筛选[31]等，组合筛选模式与单独筛选模式相比，无漏筛，具有成本低、速度快、易于大规模筛选等优势。随着活性筛选和分离技术的不断提高，人们必将从天然产物这个巨大的资源库中寻找到更多结构新颖、疗效显著的药物和先导化合物。

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Research Progress on Natural Active Ingredients by the Screening Method of Brine Shrimp Lethality Test

Guo Jingjing,Zhang Ping,Li Ruijuan,Zhao Hongmei,Yue Xin,Bao Baoquan
(College of Pharmacy,Inner Mongolia Medical University,Hohhot 010059,China)

The brine shrimp lethality test (BSLT),a kind of activity screening method,that rapidly developed in recent years is widely used for screening cytotoxicity,anticancer and protozoacide natural products,as well as a major assessment of preliminary toxicities. BSLT is operated using a primitive organism nauplii of brine shrimp (Artemia sp.) which is administered by unknown samples with various concentrations. The survivals are counted and the bioactivity index LD50 is calculated after a specified period of the cultivation in vitro. BSLT is performed on intact animals with the advantages of simple steps,short period,low cost,accurate output,as well as good repeatability. Moreover,the test normally needs only a dosage of analytes less than 20 mg,which is suitable for screening and separation of bioactive natural ingredients in pharmaceutical research work.

Brine shrimp lethality test,cytotoxicity,anticancer bioactivity,protozoacide bioactivity

10.11842/wst.2016.05.027

R284

A

（责任编辑：朱黎婷，责任译审：朱黎婷）

2016-01-30

修回日期：2016-03-13

＊ 国家自然科学基金委地区项目（81160551）：破痞去滞蒙药特穆日-敖日阳古抗肿瘤活性成分及其构效关系研究，负责人：包保全；内蒙古医科大学2015中青年人才团队项目（NYTD-2015004）：蒙药新药创制产业创新人才团队，负责人：包保全。

＊＊ 郭晶晶与张屏为共同第一作者。

＊＊＊ 通讯作者：包保全，博士，教授，主要研究方向：蒙药活性物质基础及资源研究。