HSP27、E-cadherin及Ki-67在星型胶质细胞肿瘤中的表达及意义

饶翔，杨丞

(1.海口市人民医院病理科，海南 海口 570108；2.海南医学院病理教研室，海南 海口 571199)

HSP27、E-cadherin及Ki-67在星型胶质细胞肿瘤中的表达及意义

饶翔1，杨丞2

(1.海口市人民医院病理科，海南 海口 570108；2.海南医学院病理教研室，海南 海口 571199)

目的 分析热休克蛋白27(HSP27)、上皮-钙黏素(E-cadherin)及Ki-67在星型胶质细胞肿瘤中的表达及意义。方法选取WHO分级为Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级星型胶质细胞肿瘤标本共40例，采用免疫组化检测HSP27、E-cadherin及Ki-67的表达。结果HSP27在Ⅱ级胶质瘤的表达(8/13，61.5%)与Ⅲ级(12/13，92.3%)，Ⅳ级(14/14，100.0%)比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而Ⅲ级和Ⅳ级的表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)。87.5%(35/ 40)的胶质瘤E-cadherin表达出现表达缺失或下降，组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但与HSP27的表达之间存在负性趋势。胶质瘤Ki-67指数随WHO分级增高而提高[Ⅱ级：(2.38±1.39)%、Ⅲ级：(11.07±9.73)%、Ⅳ级：(27.31±16.02)%]，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，并与HSP27的表达正相关(P＜0.05)。结论Hsp27与Ki-67的表达对判断胶质瘤组织学分级及增殖活性具有重要意义。E-cadherin表达下降可能在胶质瘤形成早期即出现，可作为星型胶质细胞发生瘤变的早期判断指标。E-cadherin可能与HSP27共同参与胶质瘤的演进。

热休克蛋白27；上皮-钙黏素；Ki-67；星型胶质细胞肿瘤

星型胶质细胞肿瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤之一，根据WHO分类，主要包括弥漫性星型细胞瘤、间变性星型细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。HSP27属小热休克蛋白家族成员(Small heat shock protein，sHSP)，在前列腺癌、肝癌、骨肉瘤等多种恶性肿瘤中均检测到HSP27的异常表达，并与患者预后相关[1-2]。Shiota等[3]发现HSP27蛋白通过调节前列腺癌上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)和细胞周期，可提高癌细胞的侵袭能力。研究发现，胶质瘤同样存在EMT现象[4]。EMT是指肿瘤细胞失去上皮细胞极性，获得较高的侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力。为此本实验采用免疫组化检测HSP27、E-cadherin和Ki-67蛋白在星型胶质细胞肿瘤中的表达，探讨三者在瘤细胞增殖活性及肿瘤发展过程中的生物学意义。

1 材料与方法

1.1 临床标本 40例样本均来自海口市人民医院病理科诊断为星型胶质细胞肿瘤病例，根据WHO中枢神经系统肿瘤分类，包括弥漫性星型细胞瘤(WHOⅡ级)13例、间变性星型细胞瘤(WHOⅢ级)13例和多形性胶质母细胞瘤(WHOⅣ级)14例；男23例，女17例，患者年龄2～78岁(中位年龄46岁)。所有患者术前均未行放、化疗。对照组8例，均为癌旁正常胶质组织。

1.2 试剂 HSP27(兔抗人多克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司)、E-cadherin(鼠抗人单克隆抗体，北京中杉金桥生物技术有限公司)；Ki-67(鼠抗人单克隆抗体，福州迈新生物技术开发有限公司)；免疫组化MaxVision检测试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。DAB显色试剂盒和EDTA修复液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法 HSP27、E-cadherin及Ki-67免疫组化所用石蜡组织均4 μm切片，HSP27抗体浓度为1:100，其余一抗为即用型。切片脱蜡、水化，3%的H2O2封闭10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次后高温高压修复，滴加一抗，室温孵育1 h；PBS冲洗三次，滴加二抗，室温下孵育20 min；PBS冲洗三次后，滴加DAB显色剂，苏木素复染，中性树胶封片。实验按照一抗说明书制备阳性对照。阴性对照用PBS液代替一抗制备。

1.4 结果判定 HSP27以胞浆或胞核出现棕黄色颗粒为阳性，在阳性区域随机选取4个高倍视野计算阳性细胞所占细胞总数百分比，判定标准[5]：阳性细胞数≤25%为(-)，26%～50%为(+)，51%～75%为(++)，＞76%为(+++)。E-cadherin以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性[6]，按阳性细胞所占计数细胞总数百分比，判定标准[7]：阳性率10%～25%为(+)，26%～50%为(++)，＞50%为(+++)，无阳性或阳性细胞＜10%为(-)。Ki-67表达于细胞核，计算阳性细胞所占计数细胞总数百分比，判定标准：阳性细胞＜1%为0，1%～10%为(+)，10%～20%为(++)，＞20%为(+++)，各组阳性率以Ki-67指数表示(Ki-67指数=均数±标准差)。

1.5 统计学方法 应用SPSS17统计软件进行数据分析，组间差异采用交叉表分析及非参数检验χ2分析，三者相关性分析采用非参数检验相关性分析，检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 HSP27在不同级别胶质瘤组中的表达 本组40例肿瘤中HSP27阳性表达为34例，总阳性率85.0%，其中Ⅱ级为61.5%(8/13)，Ⅲ级为92.3%(12/ 13)，Ⅳ级为100.0%(14/14)。统计学分析表明，Ⅱ级与Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤之间的HSP27阳性表达率比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1和表1。

图1 HSP27在不同级别胶质瘤中的表达(×100)

表1 HSP27在不同级别胶质瘤组中的表达(n=40)

2.2 Ki-67在不同级别胶质瘤组中的表达 Ⅱ级胶质瘤Ki-67指数为(2.38±1.39)%，Ⅲ级胶质瘤为(11.07±9.73)%，Ⅳ级胶质瘤为(27.31±16.02)%。采用两两比对分析表明：各级胶质瘤组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。并且HSP27与Ki-67的表达之间存在正相关性(P＜0.05)，见表2。

表2 Ki-67在不同级别胶质瘤组中的表达(n=40)

2.3 E-cadherin蛋白在不同级别胶质瘤组中的表达 本研究中E-cadherin蛋白总阳性率为12.5% (5/40)。各组的表达率分别为15.4%(2/13)(WHOⅡ级)、7.7%(1/13)(WHOⅢ级)及14.3%(2/14)(WHOⅣ级)，组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见图2、表3。

图2 E-cadherin在不同级别胶质瘤中的表达(×100)

表3 E-cadherin在不同级别胶质瘤组中的表达(n=40，例)

3 讨 论

HSP27又名27KD热休克蛋白，由定位于7q11.23的HSPB1基因编码，广泛表达在各种细胞，是细胞内信号传导的重要调节因子，具有调节细胞生长及凋亡等多种生物学功能。在正常细胞内，HSP27因受细胞周期调控而维持于低水平，当细胞处于应激状态或异常增生时，其合成增多从而促进细胞生长，抑制凋亡。研究证实，表达量异常的HSP27蛋白可通过多种信号通路或参与肿瘤EMT过程，促进肿瘤浸润和转移[8-9]。并且磷酸化修饰后的HSP27可能在IFN-β诱导的神经母细胞瘤细胞凋亡中起重要调节作用[10]。另有研究表明，HSP27与多种肿瘤耐药相关，Belkacemi等[11]通过抑制胶质母细胞瘤中HSP27转录后，发现细胞对化疗药物的敏感性增加。而Zhang等[12]也通过抑制胰腺癌细胞内HSP27的表达，证实细胞对抗肿瘤药物敏感性增强，同时使E-cadherin表达上调，抑制瘤细胞浸润和转移。本研究中Ⅱ级星型胶质细胞瘤HSP27阳性率为61.5%(8/13)，Ⅲ级为92.3%(12/13)，Ⅳ级为100.0%(14/14)，2级与Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤比较差异有统计学意义(P＜0.05)，而Ⅲ级、Ⅳ级肿瘤之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。8例肿瘤旁胶质细胞中均无HSP27表达。以上实验结果表明HSP27的表达与星型胶质细胞肿瘤的WHO分级相关，这与高级别胶质瘤(Ⅲ级、Ⅳ级)化疗耐受的临床特点一致。提示高表达的HSP27蛋白在胶质瘤演进过程中起到重要作用。Ki-67蛋白反映细胞增殖活性。Chen等[13]认为Ki-67对于判断胶质瘤患者临床特征及预后有重要意义。本研究结果亦提示随胶质瘤分级增高，Ki-67表达阳性率亦增高，其表达在不同级别胶质瘤各组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。本实验结果表明，HSP27与Ki-67表达水平之间存在正相关性(P＜0.05)，推测高表达的HSP27蛋白可能通过抑制细胞凋亡，促进胶质瘤细胞的增殖。证实HSP27及Ki-67与胶质瘤的分化及恶性程度有关，对判断肿瘤分级有意义。

E-cadherin为细胞粘附分子，是重要的EMT标记物[14]，其表达下调可促进肿瘤细胞发生转移。研究证实E-cadherin可在正常胶质细胞中表达，但胶质瘤中E-cadherin的表达与肿瘤分级的相关性分析在多个报道中不尽相同，Bar等[15]在对92例胶质瘤病例的研究中发现28.8%的胶质瘤表达E-cadherin，与分级无相关性。在本研究中，8例肿瘤旁胶质细胞E-cadherin均表达，而胶质瘤组织表现为E-cadherin的表达缺失或表达下降，其总表达率为12.5%(5/40)，组间表达差异无统计学意义。此外，因本组胶质瘤组织中E-cadherin蛋白表达阳性例数较少，与HSP27、Ki-67表达相关性没有得到确定的统计学结论，但存在负性趋势。本实验结果提示，EMT现象在星型胶质细胞肿瘤组织中较普遍，E-cadherin的表达异常可能在肿瘤形成早期即出现，可作为星型胶质细胞肿瘤发展早期的参考指标，并可能与HSP27蛋白共同参与肿瘤的演进。

综上所述，HSP27作为低分子量热休克蛋白，参与星型胶质细胞肿瘤演进，与瘤细胞的增殖活性相关，在判断肿瘤恶性程度及肿瘤分级方面具有重要意义。E-cadherin表达下调可作为星型胶质细胞肿瘤发展早期的参考指标，在肿瘤防治方面具有重要作用，但与高表达HSP27蛋白之间相关性有待进一步研究。

[1]Ciocca DR,Calderwood SK.Heat shock proteins in cancer:diagnostic,prognostic,predictive,and treatment implications[J].Cell Stress Chaperones,2005,10(2):86-103.

[2]Wang XW,Shi XH,Tong YS,et al.The prognostic impact of heat shock proteins expression in patients with esophageal cancer:a meta-analysis[J].Yonsei Med J,2015,56(6):1497-1502.

[3]Shiota M,Bishop JL,Nip KM,et al.Hsp27 regulates epithelial mesenchymal transition,metastasis,and circulating tumor cells in prostate cancer[J].Cancer Res,2013,73(10):3109-3119.

[4]Nordfors K,Haapasalo J,Mäkelä K,et al.Twist predicts poor outcome of patients with astrocytic glioma[J].J Clin Pathol,2015,68 (11):905-912.

[5]孙春婷,张会娟.CK34βE12和HSP27在甲状腺癌中的表达及其意义[J].天津医药,2009,37(6):453-455.

[6]Lewis-Tuffin LJ,Rodriguez F,Giannini C,et al.Misregulated E-cadherin expression associated with an aggressive brain tumor phenotype[J].PLoS One,2010,5(10):e13665.

[7]熊一峰,艾云志,徐姗,等.Twist和E-cadherin在人脑神经胶质瘤及其复发灶中的表达及意义[J].广东医学,2014,35(24):3840-3842.

[8]Wei L,Liu TT,Wang HH,et al.Hsp27 participates in the maintenance of breast cancer stem cells through regulation of epithelial-mesenchymal transition and nuclear factor-κB[J].Breast Cancer Res,2011,13(5):R101.

[9]Cordonnier T,Bishop JL,Shiota M,et al.Hsp27 regulates EGF/ β-catenin mediated epithelial to mesenchymal transition in prostate cancer[J].Int J Cancer,2015,136(6):E496-507.

[10]Dedoni S,Olianas MC,Onali P,et al.Interferon-β counter-regulates its own pro-apoptotic action by activating p38 MAPK signalling in human SH-SY5Y neuroblastoma cells[J].Apoptosis,2014,19(10): 1509-1526.

[11]Belkacemi L,Hebb MO.HSP27 knockdown produces synergistic induction of apoptosis by HSP90 and kinase inhibitors in glioblastoma multiforme[J].Anticancer Res,2014,34(9):4915-4927.

[12]Zhang S,Zhang XQ,Huang SL,et al.The effects of HSP27 on gemcitabine-resistant pancreatic cancer cell line through snail[J].Pancreas,2015,44(7):1121-1129.

[13]Chen WJ,He DS,Tang RX,et al.Ki-67 is a valuable prognostic factor in gliomas:evidence from a systematic review and meta-analysis [J].Asian Pac J Cancer Prev,2015,16(2):411-420.

[14]陈晓敏,郭俊明,乐东海,等.上皮一间质转化:肿瘤转移的重要调控机制[J].中国细胞生物学学报,2013,35(9):1367-1375.

[15]Bar JK,Zub L,Lis-Nawara A,et al.Expression and Interactions Between Cell Adhesion Molecules CD44v6 and E-Cadherin in Human Gliomas[J].Adv Clin Exp Med,2014,23(5):827-834.

Expression and significance of HSP27,E-cadherin and Ki-67 in astrocytic tumor.

RAO Xiang1,YANG Cheng2. 1.Department of Pathology,Haikou People's Hospital,Haikou 570108,Hainan,CHINA;2.Department of Pathology, Hainan Medical University,Haikou 571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo discuss the expression and significances of heat-shock protein 27(HSP27),E-cadherin and Ki-67 in astrocytic tumor.MethodsForty samples of astrocytic tumor were diagnosed by the Department of Pathology of Haikou People's Hospital and divided into diffusely astrocytoma(WHO gradeⅡ,13 cases),astrocytoma (WHO gradeⅢ,13 cases)and glioblastoma multiforme(WHO gradeⅣ,14 cases)according to WHO clasification of tumours of the central nervous system.Expression of HSP27,E-cadherin and Ki-67 was detected by immunohistochemistry.ResultsThe positive expression of HSP27 in the gradeⅡ(8/13,61.5%)and gradeⅢ(12/13,92.3%),gradeⅣgliomas(14/14,100.0%)were significantly different(P＜0.05).However,there was no significant difference in the expression of HSP27 between gradeⅢandⅣastrocytoma(P＞0.05).The rate of E-cadherin expression missing or decreased were 87.5%(35/40)in astrocytoma,and there was no significant difference among the three groups(P＞0.05).E-cadherin expression showed negative trend with the expression of HSP27.The Ki-67 index of astrocytoma increased with the increase of WHO grade[gradeⅡ:(238±1.39)%,gradeⅢ:(11.07±973)%,gradeⅣ:(27.31±1.602)%],and the difference between the groups has statistical significance(P＜0.05).Ki-67 index was positively correlated with the expression of HSP27(P＜0.05).ConclusionExpression of HSP27 and Ki-67 is meaningful to evaluate tumor pathologic grading and associated with the biological behavior of astrocytic tumor.Abnormal expression of E-cadherin maybe an early event in the process of tumorigenesis,which can be regarded as an index for early diagnosis.The low expression of E-cadherin and over expression of hsp27 may play an important role in the development of astrocytic tumor.

Heat-shock protein 27(HSP27);E-cadherin;Ki-67;Astrocytic tumor

R730.264

A

1003—6350（2016）10—1579—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.10.010

2015-11-01)

杨丞。E-mail：yangcheng6@sina.com