盘状红斑狼疮患者T淋巴细胞CD70基因的表达及临床意义

叶筱燕，蒙秉新，张燕，苏建英，丁艳，王玉文，王远志

（1.海南省人民医院皮肤科，海南 海口 570102；2.海南省妇女儿童医院皮肤科，海南 海口 570206）

盘状红斑狼疮患者T淋巴细胞CD70基因的表达及临床意义

叶筱燕1，蒙秉新1，张燕1，苏建英1，丁艳2，王玉文1，王远志1

（1.海南省人民医院皮肤科，海南 海口 570102；2.海南省妇女儿童医院皮肤科，海南 海口 570206）

目的 检测盘状红斑狼疮(DLE)患者外周T淋巴细胞CD70基因表达水平，并探讨CD70基因在DLE发病机理中的作用。方法RT-PCR测定2014年1月至2015年6月在我院就诊的15例活动期、15例非活动期DLE患者和同期健康体检的15例健康人(对照组)外周血T淋巴细胞CD70 mRNA转录水平，流式细胞术检测各组样本中CD4+CD70+T/CD8+CD70+T的阳性率。结果活动期和非活动期DLE患者T淋巴细胞中的CD70 mRNA转录水平分别为(4.5±0.19)和(2.9±0.09)，显著高于对照组的(1.9±0.11)，差异均有显著统计学意义(P＜0.01)，且活动期DLE患者T淋巴细胞中的CD70 mRNA的转录水平明显高于非活动期DLE患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)；活动期和非活动期DLE患者的外周血CD4+CD70+T淋巴细胞的阳性率分别为(18.82±1.22)%和(15.32±1.01)%，明显高于对照组的(14.63±0.41)%，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，且活动期DLE患者的阳性率显著高于非活动期DLE患者，统计有显著统计学意义(P＜0.01)；活动期和非活动期DLE患者T淋巴细胞中CD8+CD70+的阳性率与对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论CD70基因的过度表达在DLE的发生发展中起着重要的作用，且CD70过度表达可作为检测DLE疾病患者的一个重要指标。

盘状红斑狼疮；T淋巴细胞；CD70基因；临床意义

红斑狼疮(Lupus erythematosus，LE)是一种病谱性疾病，其有两种亚型，分别为盘状红斑狼疮(Discoid lupus erythematosus，DLE)以及系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)。DLE与SLE有许多相同的临床表现，但是DLE普遍仅局限于皮肤，极少出现严重累及内脏器官的情况，而SLE患者经常累及心血管、肾脏、肺或中枢神经系统等[1]。目前对于DLE发病的基础研究不够充分，其具体机制尚不明确，临床上至今仍缺乏有效的治疗方法。

CD70是肿瘤坏死因子家族重要的成员[2]，是CD27的配体，普遍表达于活跃的CD4+和CD8+T细胞和B细胞上。现普遍认为CD70基因亦是狼疮相关甲基化敏感基因[3-4]，CD27-CD70系统的紊乱导致一系列的免疫异常，据研究证实，CD27抗原是DLE疾病活动的一个重要标志，与疾病活动密切相关[5]。目前国内外对于这一方面的研究还很薄弱。本文通过研究活动期和非活动期DLE患者外周血T淋巴细胞CD4+和CD8+细胞中的CD70基因的分子表达水平，初步探讨DLE的发病与CD70基因表达之间的关系，以期为进一步明确DLE在基因及分子水平的发病机制提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月至2015年6月在我院住院及门诊就诊的30例DLE患者，均符合DLE诊断标准的四项指标。其中活动期DLE 15例，女性13例，男性2例，平均年龄(26.8±5.7)岁；非活动期DLE 15例，男性1例，女性14例，平均年龄(25.5±6.2)岁；对照组15例，皆为本院体检中心健康体检者，家族中无自身免疫性疾病史，女性14例，男性1例，平均年龄(27.5±5.3)岁。各组受检者的性别和年龄比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 试剂及其仪器 CD70：5'-TGCTTTGGTCCC ATTGGTCG-3'，5'-TCCTGCTGAGGTCCTGTGTGAT TC-3'(上海博亚生物技术有限公司)。QPCR反应仪为ABI 7500(ABI公司)；Real Time反应试剂盒(OMEGA公司)；逆转录试剂盒(Sigma公司)；总蛋白提取试剂盒(BestBio公司)；免疫磁珠(德国MiltenyiBiotec公司)；TRIZOL®试剂(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(美国Pmmega公司)；抗人CD4/CD8单克隆抗体BD (美国BD公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 淋巴细胞细胞分离及其核酸抽提 各组样本中取静脉血30 mL(肝素抗凝)。采用淋巴细胞分离液常规分离方法分离外周血单核细胞。按说明书操作用免疫磁珠分离T淋巴细胞CD4+和CD8+细胞。用TRIZOL试剂按操作说明操作提取总RNA以及基因组DNA，检测浓度及纯度后，-20℃保存备用。

1.3.2 实时PCR及Western blot检测CD70的表达 任取样本中所提取的RNA逆转录成cDNA为模板。以l/2×、1/4×、1/8×、1/16×、1/32×对倍稀释成五个梯度后作为模版DNA，并以CD70基因与β-肌动蛋白基因(内参照基因)的特异引物进行实时PCR，2个复孔。反应条件如下：50℃15 min，1个循环；95℃15 min，1个循环；94℃15 s，55℃30 s，40个循环；72℃30 s；内参基因为β-肌动蛋白：5'-GATGAGATTGGCATGGCTTT-3'，5'-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3'。提取CD4+CD70+T淋巴细胞总蛋白，确定蛋白样品的浓度后加入等量样品到每个加样孔，进行Western blot检测，经曝光、显影及定影后，统计目的条带灰度值。

1.3.4 流式检测T淋巴细胞中CD70 mRNA的转录水平 T淋巴细胞的检测纯度约为90%。从各组标本中分别取50 μL T淋巴细胞悬液于试管中，细胞浓度为l×106个细胞/mL，待2次洗涤后先固定细胞再加入已用FITC标记过的抗人CD70抗体，以及PE标记过的抗人CD4/CD8单克隆抗体，室温下标记时间为30 min，经洗涤后每管中加入用含0.5%甲醛的磷酸盐缓冲液，轻轻吹打混匀制成细胞悬液，然后以细胞测定数为5 000个左右的浓度上机检测，计算出每份标本中CD4+CD70+细胞及CD8+CD70+细胞占T淋巴细胞的百分率。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组受检者的CD70 mRNA表达水平比较如图1所示，与对照组比较，活动期、非活动期DLE患者T淋巴细胞CD70 mRNA转录水平明显提高，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，且活动期DLE患者的转录水平显著高于非活动期患者，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。活动期、非活动期DLE患者中T淋巴细胞CD4+细胞的CD70 mRNA转录水平，极显著高于对照组(P＜0.01)。活动期DLE患者T淋巴细胞CD4+细胞的CD70 mRNA的转录水平明显高于非活动期DLE患者中的转录水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)；活动期、非活动期DLE患者中T淋巴细胞CD8+的CD70 mRNA转录水平与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

图1 DLE患者与对照组T淋巴细胞中CD70 mRNA的水平比较

表1 DLE患者T淋巴细胞中CD70 mRNA的表达(±s)

表1 DLE患者T淋巴细胞中CD70 mRNA的表达(±s)

注：与对照组比较；aP＜0.01；与非活动期比较，bP＜0.05。

临床特征CD70 mRNA水平(ΔCt值)t/F值P值年龄(岁)≤25＞25性别t=1.520.14 12.50±0.92 12.26±0.87 t=0.260.88男女12.34±0.90 12.36±0.91 CD4+对照组非活动期活动期CD8+对照组非活动期活动期F=5.65＜0.01 13.53±0.93 12.08±0.71a11.24±0.62abF=1.310.28 12.29±0.90 12.47±0.97 12.97±0.06

2.2 三组受检者T淋巴细胞中CD70水平比较 活动期和非活动期DLE患者的外周血CD4+CD70+T淋巴细胞的阳性率分别为(18.82±1.22)%和(15.32±1.01)%，明显高于对照组的(14.63±0.41)%，差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，且活动期DLE患者的阳性率显著高于非活动期DLE患者，统计有显著统计学意义(P＜0.01)；活动期和非活动期DLE患者T淋巴细胞中CD8+CD70+的阳性率与对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，见图2。

图2 流式检测DLE患者与对照组中T淋巴细胞中CD70水平比较

2.3 CD4+CD70+T淋巴细胞CD70蛋白的Western blot检测 与对照组比较，活动期、非活动期DLE患者CD4+T淋巴细胞的CD70基因平均表达水平均提高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；活动期DLE患者中CD70基因的平均表达水平明显高于非活动期DLE患者，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图3 Western blot检测CD4+CD70+T淋巴细胞CD70蛋白水平

3 讨论

CD70是编码肿瘤坏死因子的基因之一，主要在T细胞和B细胞上表达，其配体是CD27分子[6]。体外实验的条件下处于未活化T淋巴细胞中CD70基因是很少表达的，但是处于变态反应或自身免疫反应等条件下，T淋巴细胞经刺激活化后可大量表达CD70蛋白[7]。作为T淋巴细胞的辅助/共刺激信号，CD70与CD27的结合可以对B细胞的激活进行调控[8]。

CD27-CD70的系统紊乱可引起机体的一系列免疫异常，CD27可以促进人B细胞分泌产生免疫球蛋白，且与浆细胞的分化增强有关[9]；CD70与CD27的结合可引起协同刺激信号促进B细胞分泌IgG抗体，使得狼疮患者外周血中B淋巴细胞的异常表达以及促进产生依赖T细胞分泌的IgG[10-11]。因此CD70在B细胞异常活跃中的作用，可能与LE等疾病的发生密切相关。El-Mahdy等[12]研究表明，CD4+T经过甲基化抑制剂处理后，细胞会过度表达CD70，且过度表达的CD70又将刺激B细胞分泌IgG，并且抗CD70抗体阻断能阻断这种异常分泌，这些均为T细胞过度表达CD70蛋白进而有利于促进IgG分泌增加的假说提供了必要的实验依据。

本研究结果表明，活动期和非活动期DLE患者中外周血T淋巴细胞CD4+细胞内CD70基因的转录和表达水平均明显升高，但CD70基因并未在CD8+T淋巴细胞内出现表达上调，说明CD70确实在DLE的发病机和发展过程中存在差异表达的现象。本研究还发现T淋巴细胞中CD4+CD70+的细胞阳性率以及T淋巴细胞CD4+细胞内CD70 mRNA的转录水平与DLE疾病进展活动的程度表现出正相关的趋势，因此T淋巴细胞中CD70分子转录和表达水平的高低可能可以成为衡量DLE疾病活动进展程度的又一个监测指标。

[1]Mak A,Isenberg DA,Lau CS.Global trends,potential mechanisms and early detection of organ damage in SLE[J].Nature Reviews Rheumatology,2013,9(5):301-310.

[2]Sekigawa I,Kawasaki M,Ogasawara H,et al.DNA methylation:its contribution to systemic lupus erythematosus[J].Clin Exp Med, 2006,6(3):99-106.

[3]丁艳,肖嵘,蒙秉新,等.CD70 mRNA及其蛋白在DLE患者T淋巴细胞中的表达[J].中国皮肤性病学杂志,2012,26(4):291-292.

[4]Tai X,Van Laethem F,Pobezinsky L,et al.Basis of CTLA-4 function in regulatory and conventionalCD4(+)T cells[J].Blood,2012, 119(22):5155-5163.

[5] Puizina-Ivi N.Skin aging[J].Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat,2008,17(2):47-54.

[6] Bour-Jordan H,Esensten JH,Martinez-Llordella M,et al.Intrinsic and extrinsic control of peripheral T-cell tolerance by costimulatory molecules of the CD28/B7 family[J].Immunological Reviews, 2011,241(1):180-205.

[7]Conaghan PG,Durez P,Alten RE,et al.Impact of intravenous abatacept on synovitis,osteitis and structural damage in patients with rheumatoid arthritis and aninadequate response to methotrexate:the ASSET randomised controlled trial[J].Annals of the Rheumatic Diseases,2013,72(8):1287-1294.

[8]Denoeud J,Moser M.Role of CD27/CD70 pathway of activation in immunity and tolerance[J].Journal of Leukocyte Biology,2011,89 (2):195-203.

[9]Durandy A,Kracker S.Immunoglobulin class-switch recombination deficiencies[J].Arthritis Research and Therapy,2012,14(4):218.

[10]Salama AK,Hodi FS.Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4 [J].Clinical Cancer Research,2011,17(14):4622-4628.

[11]Xu Z,Juan V,Ivanov A,et al.Affinity and cross-reactivity engineering of CTLA4-Ig to modulate T cell costimulation[J].Journal of Immunology,2012,189(9):4470-4477.

[12]El-Mahdy MA,Zhu Q,Wang QE,et al.Naringenin protects HaCaT human keratinocytes against UVB-induced apoptosis and enhances the removal of cyclobutane pyrimidine dimers from the genome[J]. Photochem Photobiol,2008,84(2):307-316.

Expression of CD70 in T lymphocytes from patients with discoid lupus erythematosus and its clinical significance.

YE Xiao-yan1,MENG Bing-xin1,ZHANG Yan1,SU Jian-ying1,DING Yan2,WANG Yu-wen1,WANG Yuan-zhi1. 1.Department of Dermatology,Hainan General Hospital,Haikou 570102,Hainan,CHINA;2.Department of Dermatology, Maternal&Child Health Hospital of Hainan Province,Haikou 570206,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of CD70 in T lymphocytes of discoid lupus erythematosus (DLE)patients and the role of CD70 in DLE pathogenesis.MethodsBlood samples were obtained from 15 patients with active DLE,15 patients with unreactive DLE and 15 normal human controls from January 2014 to June 2015.Quantitative RT-PCR and flow cytometry were applied to detect the transcriptional level of CD70 mRNA and the positive rate of CD4+CD70+T/CD8+CD70+T cells respectively.ResultsThe levels of CD70 mRNA in T lymphocytes in active DLE(4.5±0.19)and non-active DLE group(2.9±0.09)were significantly higher than that in the normal control group (1.9±0.11)(P＜0.01).Moreover,the levels of CD70 mRNA in the active DLE group was significantly higher than that in non-active DLE group(P＜0.05).The positive rate of peripheral blood CD4+CD70+T cells in active DLE group [(18.82±1.22)%]and non-active DLE group[(15.32±1.01)%]were significantly higher than that in the normal control group[(14.63±0.41)%](P＜0.05,P＜0.01).The active DLE group showed higher positive rate than non-active DLE group (P＜0.01).However,there was no significant difference between the three groups in the positive rate of CD8+CD70+T cells(P＞0.05).ConclusionThis study shows that over-expression of CD70 plays a significant role in the pathogenesis of DLE and could be used as an important index of disease detection in patients with DLE.

Discoid lupus erythematosus;T lymphocytes;CD70 gene;Clinical significance

R593.24

A

1003—6350（2016）14—2243—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.14.003

2016-01-12)

海南省卫生厅卫生计生行业科研项目(编号：琼卫2013自筹-33)

王远志。E-mail：wangyuanzhi407@163.com