普伐他汀对新生大鼠成骨细胞的作用研究

曾玉兰 曾援

·实验研究·

普伐他汀对新生大鼠成骨细胞的作用研究

曾玉兰 曾援

目的研究普伐他汀对新生大鼠成骨细胞的作用。方法用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法(MTT)、4-硝基苯磷酸二钠法(PNPP)、茜素红染色法分别检测普伐他汀对成骨细胞的活力,碱性磷酸酶(ALP)活力及骨矿化结节面积的作用。结果普伐他汀在10-8～10-4g/ml能促进成骨细胞增殖、提高成骨细胞碱性磷酸酶活性和促进新生大鼠成骨细胞骨结节形成。结论普伐他汀能促进成骨细胞增殖、分化及矿化。

普伐他汀；成骨细胞；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法；4-硝基苯磷酸二钠法；碱性磷酸酶；骨结节

世界卫生组织定义骨密度低于骨密度峰值的2.5个标准差即为骨质疏松症［1,2］。骨质疏松症是以骨量低下,骨微结构破坏,导致骨脆性增加,易发生骨折为特征的全身性代谢性骨病［3,4］。骨质疏松症的发病率随年龄的增加而增加且与雌激素水平有关［5］。流行病学研究表明,大多数骨质疏松患者为绝经期妇女,在发达国家中50岁以上妇女中约有50%的人存在骨质疏松性骨折；随着老龄人口的不断增加,60岁以上骨质疏松症患者日益增加,约有25%的60岁以上妇女发生骨质疏松症,其中约44%有骨折危险［6］。骨质疏松性骨折带来的慢性疼痛极大的影响了患者的生活质量,骨质疏松症已经成为一个严重的社会问题［7］。

骨是一个不断经历着骨重建的动态器官,成骨细胞和破骨细胞在维持骨的动态平衡中扮演着至关重要的角色［8,9］。在骨重建的过程中,首先发生的是破骨细胞骨吸收动作,随后成骨细胞在破骨凹陷处进行骨形成活性,一个完整的周期内骨形成的时间远远大于骨吸收时间,一旦被破骨细胞吸收骨质形成的凹陷不能被形成的新骨填满时将会发生负平衡,如果这种状态持续发展,骨量丢失到一定程度时,骨折的发生将不可避免［10,11］。骨质疏松症发生的根本原因就是骨吸收作用与骨形成作用的平衡被打破,骨吸收大于骨形成。增强成骨细胞活性能促进骨基质形成,促进骨的矿化形成,增加骨密度［12,13］。因此,增强成骨细胞的活性是治疗骨质疏松的基本原则。研究表明,高血脂也是绝经后妇女常见的并发症,他汀类药物具有抗骨质疏松作用已有报道［14］。本实验旨在研究本医院所购买的他汀类药物普伐他汀是否对新生大鼠颅骨成骨细胞具有积极作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 新生SD大鼠选自广西医科大学实验动物中心。

1.2 实验方法

1.2.1 成骨细胞的制备 取新生SD大鼠胎鼠(24 h内),在无菌操作台中取出颅骨,剔除骨头上黏附的结缔组织和血管,双抗浸泡数分钟后剪碎,用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA) 37℃水浴预消化后,弃上清保留骨片,骨片中加含0.1%Ⅰ型胶原酶37℃水浴消化15min后,取消化液离心10min,得到成骨细胞,重复上述胶原酶消化步骤,共消化6次,得到的细胞用10%的胎牛血清DMEM培养液置于37℃,5% CO2培养箱培养,24 h换液,以后每隔2～3 d换液1次,传代。

1.2.2 普伐他汀对新生大鼠成骨细胞增殖作用 细胞以3000个/孔细胞接种入96孔板,第1列为空白调零。细胞接种24 h后,加入不同浓度的普伐他汀,使终浓度分别是：10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml。加药后分别作用24、48、72 h,实验结束前4 h加20 μl的MTT(5mg/ml),继续在37℃、5% CO2条件下孵育,随后弃去培养液后加二甲基亚砜150 μl,振摇10min后于酶标仪检测其吸光度,检测波长570 nm,参考波长630 nm。

1.2.3 普伐他汀对新生大鼠成骨细胞ALP活性的作用 细胞以3000个/孔的密度接种入96孔板中。24 h后加入不同浓度的普伐他汀,使终浓度分别是：10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml。测定药物作用后第5、7、9天细胞的ALP含量。步骤简单描述如下,弃培养液,PBS冲洗,加入细胞裂解液50 μl,超声裂解10min,加入含25 mmol/L二乙醇胺,1 mmol/L氯化镁和6 mmol/L PNPP的反应液100 μl,37℃放置30min,然后用0.1 mol/L的NaOH 50 μl终止反应,在酶标仪于405 nm波长下测定OD值。样品OD值在ALP标准曲线上读取酶活性值(U/L)。

1.2.4 普伐他汀对新生大鼠成骨细胞骨结节形成的作用 采用维生素C和p-甘油磷酸钠诱导新生大鼠成骨细胞成熟矿化,普伐他汀5个浓度处理18 d后,取尽12孔板各孔培养上清液后,用PBS冲洗培养板2次,95%乙醇固定10min,用PBS再冲洗3次,各孔均加入0.1%茜素红1ml,于37℃下放置30min,蒸馏水冲洗、甩干。于光镜下观察,以红染、边界清晰、短径＞100 μm的标准,于40倍光镜下对各孔分别计数,各孔均重复3次。

2 结果

2.1 普伐他汀对新生大鼠成骨细胞增殖作用 成骨细胞增殖在决定新骨形成中起重要作用,普伐他汀浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml均能促进成骨细胞增殖。见表1,图1。

2.2 普伐他汀对新生大鼠成骨细胞ALP活性的作用 ALP是反映成骨细胞分化早期活性的特异指标,ALP在成骨细胞分化早期处于一个上升的过程,在此过程中其表达的多少能反映出成骨细胞的分化程度和功能状态。新生大鼠成骨细胞在普伐他汀不同浓度的刺激下,ALP活性显著升高。见表2,图2。

图1 普伐他汀对大鼠成骨细胞增殖的影响

表1 普伐他汀对大鼠成骨细胞增殖影响的OD值(±s,n=6)

表1 普伐他汀对大鼠成骨细胞增殖影响的OD值(±s,n=6)

浓度 24 h 48 h 72 h对照 0.278±0.0304 0.335±0.0313 0.339±0.0061 10-8g/ml 0.351±0.0318 0.407±0.0234 0.415±0.0282 10-7g/ml 0.357±0.0319 0.412±0.0294 0.423±0.0363 10-6g/ml 0.360±0.0462 0.425±0.0221 0.446±0.0332 10-5g/ml 0.366±0.0148 0.446±0.0222 0.447±0.0194 10-4g/ml 0.282±0.0019 0.345±0.0053 0.349±0.0039

表2 普伐他汀对新生大鼠成骨细胞ALP活性影响的OD值(±s,n=6)

表2 普伐他汀对新生大鼠成骨细胞ALP活性影响的OD值(±s,n=6)

浓度 第3天 第5天 第7天对照 1.104±0.0522 1.015±0.0463 1.036±0.1148 10-8g/ml 1.475±0.0965 1.488±0.0823 1.603±0.0774 10-7g/ml 1.583±0.2006 1.588±0.0415 1.629±0.0923 10-6g/ml 1.651±0.2007 1.689±0.0487 1.714±0.0895 10-5g/ml 1.757±0.0704 1.779±0.0706 1.848±0.0431 10-4g/ml 1.018±0.0105 1.016±0.0181 1.015±0.0024

图2 普伐他汀对新生大鼠成骨细胞ALP活性的影响

2.3 普伐他汀对新生大鼠成骨细胞骨结节形成的作用 在细胞外基质矿化期,是以骨结节的形成及数量为特征。骨结节是分化成熟成骨细胞形成多层叠加的结节样结构,同时骨结节是衡量成骨细胞分化晚期活性的指标。化合物在浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml作用20 d后,能够影响新生大鼠成骨细胞骨结节形成。见图3。

图3 普伐他汀对成骨细胞骨矿化结节的影响

3 讨论

骨质疏松症是由多种原因引起的退行性骨骼疾病,以骨量减少、骨微结构破坏导致骨脆性增加易发生骨折为特征。促进成骨细胞增殖分化以及矿化是防治骨质疏松的策略之一,本实验通过体外实验细胞水平将普伐他汀作用于成骨细胞,研究其对成骨细胞的作用。

本实验选择酶消化法来分离原代成骨细胞。酶消化法是指新生大鼠颅骨剪碎后,经胰酶和Ⅰ型胶原酶在37℃水浴下反复消化5次,收集上清液在800 rpm离心10min后,取细胞沉淀接种于培养瓶中得到原代成骨细胞的方法。原代成骨细胞贴壁生长24 h后更换培养基,去除未贴壁的成纤维细胞、软骨细胞等杂质细胞,待细胞长满至培养瓶底80%时进行传代培养。此后通过换液和传代不断去除杂质细胞,细胞传至第3代时,可得到纯化的成骨细胞用于实验研究。本研究结果发现：成骨细胞增殖在决定新骨形成中起重要作用,普伐他汀浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml均能促进成骨细胞增殖。ALP是反映成骨细胞分化早期活性的特异指标,ALP在成骨细胞分化早期处于一个上升的过程,在此过程中其表达的多少能反映出成骨细胞的分化程度和功能状态。新生大鼠成骨细胞在普伐他汀不同浓度的刺激下,ALP活性显著升高。在细胞外基质矿化期是以骨结节的形成及数量为特征。骨结节是分化成熟成骨细胞形成多层叠加的结节样结构,同时骨结节是衡量成骨细胞分化晚期活性的指标。化合物在浓度为10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/ml作用20 d后,能够影响新生大鼠成骨细胞骨结节形成。

成骨细胞是骨形成过程中的重要功能细胞,它能够表达很多种离子通道来促进骨形成,同时在骨重建过程中能够间接的调节破骨细胞骨吸收过程,对骨重建、骨损伤修复起到了关键的作用［15］。成骨细胞增殖期细胞数量增加,在成骨分化早期成骨细胞表达ALP并释放类骨质形成钙化沉积,同时在骨形成过程中分泌的Ⅰ型胶原酶也能够帮助矿化形成钙化结节［16］。目前常将ALP和钙化结节作为成骨细胞鉴定的评价指标。

综上所述,普伐他汀在浓度为10-5、10-6、10-7、10-8g/ml提高成骨细胞的活力,促进成骨细胞的增殖,在相同作用浓度下,成骨细胞ALP增高。但是其作用机制尚未阐明,有待于进一步研究。

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Research of effect by pravastatin for osteoblast in infant rats

ZENG Yu-lan,ZENG Yuan.Nanxiong City People’s Hospital,Nanxiong 512400,China

ObjectiveTo research effect by pravastatin for osteoblast in infant rats.Methods3-(4,5-dimethylthiahiazo-2)-2,5-phenytetrazoliumromide (MTT),4-nitrophenyl phosphate (PNPP) and alizarin red staining were applied respectively to detect activity of pravastatin for osteoblast,activity of alkaline phosphatase (ALP),and effect of bonemineralization nodule area.ResultsPravastatin in concentration of 10-8～10-4g/ml accelerated osteoblast multiplication,and improve activity of osteoblast ALP,and promote osteoblast bone nodule formation in infant rats.ConclusionPravastatin can accelerate multiplication,differentiation andmineralization in osteoblast.

Pravastatin; Osteoblast; 3-(4,5-dimethylthiahiazo-2)-2,5-phenytetrazoliumromide; 4-nitrophenyl phosphate; Alkaline phosphatase; Bone nodule

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.10.214

2016-02-02］

512400 南雄市人民医院

曾援