ROS1在肺腺癌组织中的表达及临床意义

梁小芹王卓常守凤张晓玲陈城王金穗苏勤军

作者单位：730000 兰州1甘肃省人民医院病理科；730050 兰州2兰州军区兰州总医院病理科

临床研究

ROS1在肺腺癌组织中的表达及临床意义

梁小芹1王卓1常守凤1张晓玲1陈城1王金穗1苏勤军2

作者单位：730000 兰州1甘肃省人民医院病理科；730050 兰州2兰州军区兰州总医院病理科

目的探讨肺腺癌组织中ROS1蛋白的表达及其临床意义。方法应用免疫组织化学染色法（immunohistochemical，IHC）检测332例肺腺癌组织和55例相应癌旁正常肺组织中ROS1蛋白的表达，分析ROS1蛋白表达与临床病理特征、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）和患者术后复发转移的关系。结果ROS1蛋白在肺腺癌组织和相应癌旁正常肺组织中的阳性表达率分别为6%（20/332）和0，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；ROS1蛋白阳性表达在不同年龄、性别肺腺癌患者中的差异无统计学意义（P＞0.05）；与吸烟史及TNM分期有关（P＜0.05），ROS1蛋白阳性组和阴性组中位无病生存期分别为19个月和42个月，差异有统计学意义（P＜0.05），1年复发率分别为30%和13.5%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论ROS1蛋白在肺腺癌组织中低表达，ROS1对肺腺癌患者术后生存期和复发转移有一定影响，检测肺腺癌患者ROS1蛋白对指导个体化治疗有重要意义。

肺肿瘤；ROS1；免疫组织化学染色；表皮生长因子；间变性淋巴瘤激酶；预后

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其中腺癌是其主要的组织学类型，大部分患者就诊时已属中晚期，治疗多以放化疗为主，但疗效不理想。近年来，随着分子生物学的发展和对肿瘤发病机制的深入研究，以特定分子为靶点的靶向抗肿瘤药物，取得了较好疗效。以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变而开发的吉非替尼和厄洛替尼，以及针对间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）融合基因的蛋白激酶抑制剂克唑替尼（crizotinib）等药物已广泛应用于临床，为肺腺癌患者带来新的希望［1-2］。近年ROS1、RET、KRAS、MET、HER-2、BRAF及PI3KCA等基因相继在肺腺癌中被报道［3］，其中ROS1融合基因是继EGFR和ALK之后发现的又一治疗新靶点，其在非小细胞肺癌中的阳性率为1%～3%［4-5］。目前研究表明，靶向药物克唑替尼对ROS1融合基因的患者有效，因此，检测肺腺癌患者ROS1蛋白对指导患者个体化治疗有重要意义。本研究应用免疫组织化学染色法（immunohistochemical，IHC）对332例肺腺癌组织和55例相应癌旁肺组织中ROS1蛋白的表达进行检测，分析ROS1蛋白表达的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集甘肃省人民医院和兰州军区总医院2007年1月至2016年1月经病理确诊为肺腺癌的332例石蜡包埋的肿瘤组织（肺腺癌组）。年龄32～77岁，中位年龄59岁，＜60岁157例，≥60岁175例；男性177例，女性155例；有明确吸烟史181例，无吸烟史151例。根据2015年WHO肺腺癌分类标准进行组织学分类，其中实体型85例，腺泡型70例，乳头型63例，贴壁型52例，微乳头型47例，黏液腺癌15例；临床分期采用2013年肺癌分期标准进行TNM分期，其中Ⅰ期73例，Ⅱ期114例，Ⅲa期70例，Ⅲb期53例，Ⅳ期22例。以距肺腺癌组织5 cm的正常肺组织55例作为对照（正常肺组织组）。所有患者标本采集均获得医院伦理委员会批准及患者知情同意。随访从术后病理确诊为肺腺癌开始，随访内容为患者肿瘤标志物的水平及影像学资料（头、胸部CT检查，必要时完善骨扫描等相关检查）。出院后每2个月随访1次，随访2年；第3年每3个月随访1次，之后每年随访2次，随访时间截至2016年4月1日。

1.2 主要试剂及仪器

兔抗人ROS1单克隆抗体（克隆号：D4D6）购自美国CST公司，兔抗人ALK单克隆抗体（克隆号：D5F3）购自瑞士罗氏公司，兔抗人EGFR受体单克隆抗体（克隆号：EP22）购自中杉金桥生物技术有限公司，全自动免疫组织化学染色机购自瑞士罗氏公司。

1.3 检测方法

1.3.1 组织芯片的制作 经2名病理科医生阅片并选取有代表性的肿瘤区域，手动制作仪制作组织芯片，每例取3点。

1.3.2 IHC 将石蜡包埋的组织制成4 μm的切片，用瑞士罗氏全自动多功能病理组织检测系统进行IHC检测，ROSI、ALK和EGFR严格按试剂盒说明书操作，ROSI工作浓度为1∶200，ALK和EGFR为工作液。以PBS代替一抗作阳性对照，用已知阳性切片作阳性对照。

1.4 结果判定

1.4.1 ROS1融合蛋白主要定位于细胞质中，以细胞质呈浅黄色至棕褐色为阳性，EGFR蛋白主要定位于细胞膜。按阳性强度和面积分别标记为0、1+、2+、3+，评分标准如下：0表示肿瘤细胞无任何染色或只有细胞核着色；1+为肿瘤细胞质呈浅棕色，且无任何背景染色；2+为肿瘤细胞质呈棕色（<50%的肿瘤细胞着色）；3+为肿瘤细胞质呈深棕色（>50%的肿瘤细胞着色）。

1.4.2 ALK阳性为肿瘤细胞中存在强颗粒状细胞质染色（任何百分比的阳性肿瘤细胞）。阴性为肿瘤细胞内不存在强颗粒状细胞质染色。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。ROS1及ALK融合基因突变与临床病理特征的关系用字2检验，用Kaplan-Meier进行生存分析，行log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ROS1蛋白在肺腺癌组织中的表达

332例肺腺癌组织中20例呈不同程度的ROS1蛋白阳性表达，阳性率为6%（20/332）；55例癌旁正常肺组织中，无ROS1蛋白表达（图1A），两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。20例ROS1蛋白阳性表达的病例中有2例为1+（图1B），5例为2+（图1C），13例为3+（图1D）。

图1 ROS1在肺腺癌组织和癌旁正常肺组织中的表达（IHC×200）

2.2 ROS1蛋白阳性表达与肺腺癌临床病理特征的关系

20例ROS1蛋白阳性表达中男性8例，女性12例，差异无统计学意义（P＞0.05）；≤60岁患者ROS1蛋白阳性表达率为8.3%（13/157），>60岁为4%（7/175），两者比较差异无统计学意义（P＞0.05）；无吸烟史患者的ROS1蛋白阳性表达率为9.3%（14/151），有吸烟史患者为3.3%（6/181），两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。临床分期：ROS1阳性表达I期1例、Ⅱ期5例、Ⅲ期9例、Ⅳ期5例，Ⅲ+Ⅳ期的阳性表达率为9.6%（14/146），Ⅰ+Ⅱ期阳性表达率为3.2%（6/186），差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。组织学类型：ROS1蛋白阳性表达实性型7例、乳头型5例、腺泡型3例、黏液腺癌3例、贴壁型2例，以实性型和乳头型为主。

2.3 肺腺癌组织中ALK及EGFR蛋白的表达与ROS1的关系

在332例肺腺癌组织中，EGFR蛋白阳性表达116例，其中3+95例，2+13例，1+8例，1例伴有ROS1蛋白阳性表达；216例EGFR阴性表达的病例中ROS1蛋白阳性表达19例，差异有统计学意义（P＜0.05）。在332例肺腺癌中ALK阳性表达28例，无ROS1蛋白表达；在304例ALK阴性表达的病例中，ROS1蛋白阳性表达20例，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 ROS1蛋白阳性表达与肺腺癌临床病理特征的关系〔n（%）〕

2.4 肺腺癌组织中ROS1蛋白表达与患者预后的关系

332例患者中失访27例，最长随访时间为83个月。ROS1蛋白阳性表达者中位无病生存期（diseasefree survival，DFS）为19个月，ROS1蛋白阴性表达者为42个月，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）。ROS1蛋白阳性表达者1年复发率为30%，明显高于阴性表达者的13.5%（字2=4.157，P＜0.05）。

3 讨论

人类ROS1基因属于Ⅱ类受体酪氨酸激酶的胰岛素受体基因，定位于人类第6号染色体q22区。ROS1受体酪氨酸激酶参与激活多条下游信号传导通路，包括RAS-MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT3以及SHP2/VAV3和PLCγ/IP3，调控肿瘤细胞生长、增殖、分化及细胞周期［6］。近年研究发现ROS1基因在多种肿瘤细胞中高表达，其基因重排最初在神经胶质细胞瘤中被发现［7］。Rikova等［8］利用磷酸化蛋白质组学技术证实了肺腺癌中存在ROS1基因重排。目前的临床资料表明，ALK抑制剂克唑替尼对治疗ROS1融合基因的肺腺癌患者有明显疗效［9-10］。2016年美国食品与药品管理局（FDA）批准克唑替尼作为ROS1突变型非小细胞肺癌治疗用药，ROS1成为继EGFR和EML4-ALK后肺腺癌治疗的新靶点。

ROS1融合基因的主要检测方法包括荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-poly-merase chain reaction，RT-PCR）及IHC，三种方法各有优缺点。FISH技术敏感度高，特异性强，但操作繁琐，耗时长。RTPCR操作简单快速，灵敏度高，但对组织中RNA的质量要求较高，不能检测新的未知融合型。IHC在病理实验室应用普遍，成本低、简便快速，可作为筛选ROS1阳性病例的常规技术。近期的研究表明单克隆抗体（D4D6）是一种新颖、高敏感、高特异的抗体，可以准确地检测出ROS1蛋白。Yoshida等［11］应用D4D6单克隆抗体检测了270例肺腺癌患者，其中17例ROS1蛋白强阳性表达，经FISH及RT-PCR法检测，有15例存在ROS1基因重排，IHC检测ROS1基因重排的敏感度及特异度高达94%和98%。此外，Kim等［12］分别采用IHC、FISH及RT-PCR法检测肺腺癌组织中ROS1基因重排，发现应用D4D6抗体检测ROS1基因重排的敏感度和特性异度均为100%。因此，本研究选用D4D6抗体检测肺腺癌组织中ROS1蛋白的表达。结果显示，ROS1蛋白在肺腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常肺组织，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示ROS1在肺腺癌的发生中起一定作用。现有的研究表明西方人群ROS1基因重排在肺腺癌组织中的阳性率较低，而东方或亚裔人群较高。Boyle等［13］对208例无吸烟史肺腺癌患者进行检测，发现ROS1基因重排阳性率为3.4%（7/208）。Chen等［14］检测了253例肺腺癌患者，发现ROS1基因重排率为7.5%（19/253）。本研究ROS1蛋白阳性检出率为6%（20/332），与上述文献报道相近。本研究发现无吸烟史患者ROS1蛋白阳性表达14例，明显高于有吸烟史者（6例）；临床分期中Ⅲ+Ⅳ期患者ROS1蛋白阳性表达14例，明显高于Ⅰ+Ⅱ期。20例ROS1蛋白阳性的肺腺癌组织学类型中实体型和乳头型共12例（60%），推测ROS1蛋白阳性多见于组织成分中实性和（或）乳头状成分显著的分化差的肺腺癌。本研究表明ALK及ROS1蛋白表达阳性患者同样具有年轻化和无吸烟史，同时组织学类型上也有一定重叠性，即以恶性度高的实性型及乳头型较为多见，这一研究结果与文献［15］报道一致。

以往研究表明肺腺癌组织中ROS1蛋白阳性表达往往与EGFR突变及ALK基因融合有交互关系，即ROS1蛋白表达阳性的患者一般不伴有EGFR突变和ALK基因融合，本研究332例肺腺癌组织中ALK阴性表达304例，阳性表达28例，无ROS1蛋白表达；EGFR阴性表达216例，阳性表达116例，其中在阳性表达的患者中1例有ROS1蛋白表达，Cao等［16］也有类似报道。表明ROS1蛋白表达与其他基因突变/融合共存，尤其是伴随EGFR突变。

Cao等［16］检测了肺腺癌组织中ROS1基因重排，观察ROS1在肺腺癌组织中的表达与预后的关系，发现ROS1阳性表达组预后较差，总生存期明显缩短。本组肺腺癌患者单因素生存分析显示，ROS1蛋白阳性表达组中位无病生存期为19个月，阴性表达组为42个月，两组差异具有统计学意义，提示ROS1与肺腺癌的预后密切相关。Yan等［17］采用FISH法检测754例非小细胞肺癌术后组织标本的ROS1基因重排，并进行随访，结果提示术后复发与未复发患者ROS1蛋白表达率差异有统计学意义（P=0.024）。本研究中ROS1蛋白检测结果显示术后复发患者的表达率高于未复发患者，阳性表达者术后复发风险更大，可能是术后复发风险的预测因子。

综上所述，本研究采用D4D6单克隆抗体检测332例肺腺癌组织中的ROS1蛋白表达，发现肺腺癌组织中ROS1蛋白阳性多见于无吸烟史及临床分期较晚的患者，组织学类型主要以分化差的实性型及乳头型为主，且复发率更高，提示抑制ROS1蛋白的表达或许能够延长复发时间，提高患者总生存期。

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［2016-08-23收稿］［2016-09-15修回］［编辑 江德吉］

ROS1 expression in pulmonary adenocarcinoma and its clinical significance

Liang Xiaoqin1，Wang Zhuo1，Chang Shoufeng1，Zhang Xiaoling1，Chen Cheng1，Wang Jinsui1，Su Qinjun2（1Department of Pathology，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou 730000，P.R.China；2Department of Pathology，Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Command of PLA，Lanzhou 730050，P.R.China）

Wang Jinsui.E-mail：lgwjs@163.com

objective To detect the expression of ROS1 protein and its potential clinical significance in patients with pulmonary adenocarcinoma.MethodsFormalin-fixed，paraffin-embedded tissue microarrays prepared from 332 patients with pulmonary adenocarcinoma and 55 samples of adjacent normal lung tissue were analyzed for ROS1 expression using immunohistochemistry. Possible relationships were analyzed between ROS1 expression and clinicopathologic features or EGFR/ALK protein expression，as well as between protein expression and postoperative recurrence.ResultsThe rate of ROS1 expression was 6%in pulmonary adenocarcinoma tissues and 0 in adjacent normal lung tissue（P＜0.05）.ROS1 expression did not correlate with age or gender，but it did correlate significantly with smoking history and clinical stage（P＜0.05）.Disease-free survival was 42 months in ROS1-negative patients and 19 months in ROS1-positive patients（P＜0.05）.Rate of recurrence at 1 year was 30%in ROS1-negative patients and 13.5%in ROS1-positive patients（P＜0.05）.ConclusionExpression of ROS1 protein is low in pulmonary adenocarcinoma.ROS1 may be a prognostic factor that predicts risk of recurrence and metastasis of lung adenocarcinoma.Screening for ROS1 expression may help guide clinical treatment.

Lung neoplasms；ROS1；Immunohistochemistry；Epidermal growth factor receptor；Anaplastic lymphoma kinase；Prognosis

R734.2

A

1674-5671（2016）06-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2016.06.06

甘肃省科技支撑计划-社会发展类基金资助项目（144FKCA095）

王金穗。E-mail：lgwjs@163.com