雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠脊髓和背根神经节中白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α表达的影响及其与镇痛的关系

陈　伟　张旭东　逯卓卉　韦登明　林　荣

(宁波大学医学院病理学教研室，浙江　宁波　315211)



雷公藤内酯醇对佐剂性关节炎大鼠脊髓和背根神经节中白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α表达的影响及其与镇痛的关系

陈伟张旭东逯卓卉韦登明林荣

(宁波大学医学院病理学教研室，浙江宁波315211)

〔摘要〕目的观察不同剂量雷公藤内酯醇(TP)对佐剂性关节炎(AA)大鼠脊髓背角和背根神经节(DRG)中白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α表达的影响，探讨TP对AA镇痛作用的脊髓神经生物学机制。方法选用SD大鼠50只，随机分成正常组(A组)、模型组(B组)、TP低(C组)、中(D组)、高(E组)剂量治疗组。造模后14 d，C、D、E组大鼠采取不同剂量TP腹腔注射给药，每天1次，连续给药9 d。检测大鼠热痛阈，免疫组化技术检测腰5(L5)脊髓背角和DRG节段中IL-1β、TNF-α的表达变化。结果治疗9 d后，B组大鼠热痛阈显著低于A组(P<0.01)，C、D、E组热痛阈显著高于B组(P<0.05,P<0.01)，TP可显著提高AA大鼠热痛阈；B组大鼠L5节段脊髓背角和DRG中IL-1β、TNF-α阳性表达水平显著高于A组(P<0.01)，C、D、E组大鼠L5节段脊髓背角和DRG中IL-1β、TNF-α阳性表达水平显著低于B组(P<0.01)。结论TP对RA具有良好镇痛作用；TP可能是通过下调AA大鼠脊髓背角和DRG中IL-1β、TNF-α的表达水平起到镇痛作用。

〔关键词〕雷公藤内酯醇；佐剂性关节炎；镇痛；白细胞介素-1β；肿瘤坏死因子-α

第一作者：陈伟(1989-)，男，硕士，主要从事关节炎镇痛机制研究。

类风湿关节炎(RA)是一种慢性全身性自体免疫性疾病，流行病学研究显示成年人RA发病率为0.2%~0.8%〔1〕。疼痛是RA最主要的症状，严重影响身体的功能和健康，控制疼痛是治疗RA的首要环节，也是判定该病疗效的标准之一〔2〕。雷公藤内酯醇(TP)是中药雷公藤药理活性最强的化学单体，对RA具有良好的镇痛作用，现有镇痛作用研究主要集中在TP对关节局部及血液中炎性细胞因子的影响。已有资料表明〔3,4〕，关节炎疼痛的发生与脊髓白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α的增加有关，抑制脊髓IL-1β、TNF-α的表达可以产生明显镇痛作用，而TP对RA的镇痛作用与脊髓中枢神经细胞IL-1β、TNF-α表达关系尚未见报道，TP阻断RA痛觉传导的脊髓中枢神经机制仍不清楚。本实验在建立佐剂性关节炎(AA)大鼠模型基础上，以热痛阈、腰5(L5)节段脊髓和背根神经节(DRG)中IL-1β、TNF-α表达水平为观察指标，探讨不同剂量TP对AA的镇痛作用及其与脊髓和DRG中IL-1β、TNF-α表达水平变化的关系。

1材料与方法

1.1动物和药品SD大鼠50只，体质量180~220 g，由宁波大学实验动物中心提供，合格证0102013。饲养环境安静，室温20℃左右，明暗各12 h，自由摄食，饮水。TP(纯度为99.9%，批号20130111)购于上海科卫医疗技术研究所产品，将20 mg TP于4 ml 1,2-丙二醇中99℃水浴6 h溶解，加96 ml生理盐水使TP终浓度为200 μg/ml，同时制备4%丙二醇水溶液100 ml，过滤除菌分装，4℃冰箱保存备用。

1.2主要试剂与仪器①主要试剂；弗氏完全佐剂：美国Sigma公司产品；戊巴比妥钠:德国Merck公司产品；兔抗IL-1β、TNF-α多克隆抗体原液：博士德公司产品；DAB显色试剂盒：博士德公司产品；SP免疫组化染色试剂盒：博奥森公司产品。②主要仪器：ZH-LUO/B鼠尾测痛仪：正华生物仪器公司；HM-325石蜡切片机：德国LEICA公司；BM-Ⅶ包埋机：宏业医用仪器公司；CX40生物显微镜：日本olympus公司。

1.3方法

1.3.1动物分组及AA大鼠模型制备适应性喂养1 w后，采用简单随机的方法将SD大鼠分成正常组(A组)、模型组(B组)、低剂量治疗组(C组)，中剂量治疗组(D组)，高剂量治疗组(E组)，大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，A组于右后趾皮内注入0.1 ml生理盐水，其余各组大鼠在相同部位注入0.1 ml弗氏完全佐剂制备AA大鼠模型，待继发关节炎出现，标志造模成功，大约需要10~14 d。造模后第14天，A组和B组大鼠腹腔注射等体积4%丙二醇溶液，C、D、E组大鼠分别按0.1、0.2、0.4 mg/kg腹腔注射TP溶液，每日1次，连续9 d。

1.3.2热痛阈测定分别于造模前1 d，造模后14 d、23 d(TP治疗9 d)，用鼠尾测痛仪测定各组大鼠热痛阈。测定时将鼠尾测痛仪温度调为55℃，将距大鼠尾尖0.5 cm处对准测痛光源，由辐射开始到大鼠尾摆动以逃避辐射热的时间为甩尾的潜伏期，连续测3次，每次间隔>5 min，将3次甩尾潜伏期的平均值作为热痛阈。

1.3.3各组大鼠L5节段脊髓和DRG中IL-1β、TNF-α的表达造模后23 d，大鼠热痛阈测定结束后，经左心室灌流固定，先以37℃生理盐水快速冲洗，直至由右心耳流出的液体清亮无色，然后用4℃预冷的4%多聚甲醛先快后慢灌流固定，灌注完毕后取L5节段脊髓和DRG，入4%多聚甲醛固定液固定24 h后，L5节段脊髓和DRG经脱水，石蜡包埋、切片、按照试剂盒说明书进行IL-1β、TNF-α免疫组织化学染色。每只动物随机选取脊髓和DRG切片各3张，分别在×200、×400倍镜下取6个视野进行图像分析(JD801形态学图像分析系统)，测量阳性产物的积分光密度(IOD)。

1.4统计学方法采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1不同剂量TP对AA大鼠热痛阈的影响造模前各组大鼠热痛阈无显著差异(P>0.05)。造模后14 d，A组大鼠热痛阈显著高于B组(P<0.01)；造模后23 d(TP治疗9 d)，C、D、E组热痛阈显著高于B组(P<0.05,P<0.01,P<0.01)，D组热痛阈显著高于C组(P<0.05)，E组热痛阈显著高于C、D组(P<0.01,P<0.01)。见表1。

表1　各组大鼠热痛阈变化

与B组比较:1)P<0.05,2)P<0.01;与C组比较:3)P<0.05,4)P<0.01;与D组比较:5)P<0.01；下表同

2.2不同剂量TP对各组大鼠L5脊髓背角和DRG中TNF-α含量变化影响造模后23 d，处死动物后提取相应节段脊髓和DRG，制备石蜡切片，免疫组化染色观察。B组大鼠L5 DRG和脊髓背角中TNF-α表达明显增加，与A组比较差异有显著性(P<0.01)，经TP治疗后C、D、E组IOD均显著低于B组(P<0.01)；D组显著低于C组(P<0.01)；E组显著低于C、D组(P<0.01)，见表2。

表2　各组大鼠L5脊髓背角和DRG中TNF-α

2.3不同剂量TP对各组大鼠L5脊髓背角和DRG中IL-1β含量变化影响L5DRG和脊髓背角中B组IL-1β的IOD均显著高于A组(P<0.01)；经TP治疗后，C、D、E组IL-1β的IOD均显著低于B组(P<0.01)；并且D组均显著低于C组(P<0.01)；L5DRG中，E组显著低于C、D组(P<0.01)；L5脊髓背角中，E组显著低于C组(P<0.01)，与D组之间无显著差异(P>0.05)。见表3。

表3　各组大鼠L5脊髓背角和DRG中IL-1β阳性

3讨论

雷公藤属卫茅科植物，是一种具有清热解毒，祛风通络，舒筋活血，除湿消肿止痛的中草药，TP是雷公藤药理活性最强的化学单体，具有良好的镇痛作用。疼痛是RA最主要的症状，对RA患者进行镇痛治疗及了解RA疼痛的发生机制是目前的研究热点。研究发现〔5〕，关节炎持续性疼痛产生的原因可能与中枢敏化现象相关，患者处于免疫功能异常等病理状态时，脊髓的胶质细胞就会被激活，释放出多种致痛物质，例如IL-1β、TNF-α，一方面作用于痛觉神经元，使其兴奋性增强，向高级中枢传递疼痛信号，另一方面降低神经元的兴奋阈值，造成中枢敏化，使很多正常时不能引起疼痛的低强度刺激也能激活伤害性感受器。同时，这些细胞因子还可以作用于胶质细胞，产生正反馈作用，进一步增加细胞因子的数量，造成持续性疼痛。

痛阈是目前被广泛采用以判断镇痛效果的指标。本实验说明AA大鼠发生痛觉超敏，低、中、高剂量TP均起到了镇痛作用，尤其以高剂量组起效快，效果好。 在AA大鼠热痛阈显著降低的同时，一些促炎症因子作为启动因子，通过影响神经系统中的某些关键环节，在伤害性刺激信息传递过程中发挥重要作用。已经有研究发现，脊髓中IL-1β可以通过增加NR1亚基的磷酸化来易化疼〔6〕。IL-1β是一种重要的炎性细胞因子，可作用于机体的各个系统，具有广泛的生物学活性。Sung等〔7〕研究显示Wistar大鼠鞘内注射IL-1β会造成痛觉过敏，并上调脊髓内iNOS的表达。Shi等〔8〕的研究显示IL-1β可在环氧化酶的作用下，上调脊髓中致痛物质PGE2的表达，表明IL-1β在中枢神经系统中参与痛觉调制，与痛敏的发展密切相关。TNF-α是一种前炎性细胞因子，有多种生物学效应，与疼痛的产生和持续存在密切关系。激活的神经细胞和神经胶质细胞增加了脊髓中的TNF-α的表达，并进一步与其受体TNFR1结合上调了背角NR1亚基的磷酸化，从而易化了脊髓痛信号的传递，引起机体痛觉过敏和异常性疼痛的发生〔9〕。Homma等〔10〕将外源性TNF-α导入正常SD大鼠L5DRG中，发现TNF-α会引发疼痛及痛觉超敏，提示内源性TNF-α参与了大鼠早期痛觉超敏的发生。可见IL-1β及TNF-α在脊髓痛觉调制中起重要作用。

目前的镇痛研究主要针对TP对关节局部及血中炎性因子IL-1β、TNF-α的影响。Zhang等〔11〕的研究显示雷公藤可显著降低CIA模型大鼠血清TNF-α水平。Jiao等〔12〕的研究也表明TP可显著抑制体外培养大鼠小胶质细胞分泌IL-1β及TNF-α。但是TP对脊髓炎性因子IL-1β、TNF-α表达的影响及其镇痛的神经生物学机制，国内外文献尚未见报道。本实验表明AA的疼痛与脊髓背角和L5DRG中IL-1β及TNF-α的表达增加有关，在RA形成后，来自外周伤害性信息传入增加，导致DRG神经元和脊髓内IL-1β及TNF-α进一步增多，加重疼痛的发生。TP可明显抑制AA大鼠脊髓背角和L5DRG中IL-1β及TNF-α的表达。分析这一结果产生的可能原因为：在关节炎形成后，TP使伤害性刺激信息传入减少，因而脊髓背角和L5DRG中IL-1β及TNF-α的合成也相应减少。综上所述，本研究结果提示TP对RA的镇痛作用可能与其下调脊髓背角和L5DRG中TNF-α和IL-1β阳性产物表达有关，其具体的生物学机制有待进一步研究加以明确。

4参考文献

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5Yang JL,Liu JY.Research development on neuropathic pain〔J〕.J Yunyang Med Coll,2005;24(2):121-2.

6Zhang RX,Li A,Liu B,etal.IL-1ra alleviates inflammatory hyperalgesia through preventing phosphorylation of NMDA receptor NR-1 subunit in rats〔J〕.Pain,2008;135(3):232-9.

7Sung CS,Wen ZH,Chang WK,etal.Intrathecal interleukin-1beta administration induces thermal hyperalgesia by activating inducible nitric oxide synthase expression in the rat spinal cord〔J〕.Brain Res,2004;1015(1-2):145-53.

8Shi L,Smolders I,Umbrain V,etal.Peripheral inflammation modifies the effect of intrathecal IL-1beta on spinal PGE2 production mainly through cyclooxygenase-2 activity.A spinal microdialysis study in freely moving rats〔J〕.Pain,2006;120(3):307-14.

9高峰.TNF-α通过上调脊髓背角NR1磷酸化表达介导大鼠痛觉过敏及异常疼痛〔D〕.太原：山西医科大学,2011.

10Homma Y,Brull SJ,Zhang JM.A comparison of chronic pain behavior following local application of tumor necrosis factor alpha to the normal and mechanically compressed lumbar ganglia in the rat〔J〕.Pain,2002;95(3):239-46.

11Zhang Y,Xu W,Li H,etal.Therapeutic effects of total alkaloids of Tripterygium wilfordii Hook f.on collagen-induced arthritis in rats〔J〕.J Ethnopharmacol,2013;145(3):699-705.

12Jiao J,Xue B,Zhang L,etal.Triptolide ihibits amyloid-beta1-42-induced TNF-alpha and IL-1beta production in cultured rat microglia〔J〕.J Neuroimmunol,2008;205(1-2):32-6.

〔2014-08-31修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

通讯作者：林荣(1978-)，男，实验师，主要从事类风湿关节炎防治机制研究。

基金项目：宁波市药物依赖及共患精神疾病防治创新团队项目(2009B21002)；宁波市自然科学基金项目(2014A610247)；宁波大学学科项目(XKL14D2102)

〔中图分类号〕R285.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)04-0808-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.04.017