早期补救ICSI对首次IVF助孕周期临床结局的影响

刘兰兰，蔡嘉力，任建枝

(中国人民解放军第一七四医院生殖医学中心，厦门　361000)



早期补救ICSI对首次IVF助孕周期临床结局的影响

刘兰兰，蔡嘉力，任建枝*

(中国人民解放军第一七四医院生殖医学中心，厦门361000)

【摘要】目的探讨早期补救ICSI对首次IVF周期临床结局的影响。方法回顾性分析2008年1月至2012年12月于本中心行首次IVF治疗的5 029个取卵周期，IVF受精4～6 h后根据第二极体的排出情况判断受精与否，对半数以上卵母细胞未受精的患者实施补救ICSI，其余患者继续行常规IVF，比较补救ICSI组(n=413)及常规IVF组(n=4 616)患者的基本情况及临床结局，并计算早期补救ICSI对首次IVF周期临床结局的贡献值。结果早期补救ICSI组原发性不孕患者的比例及不育年限显著高于常规IVF组，输卵管及盆腔因素患者的比例显著低于常规IVF组，基础FSH显著低于常规IVF组，窦卵泡数显著高于常规IVF组(P均<0.01)；补救ICSI组获得了较多的卵母细胞数[(9.65±5.20)vs.(8.89±5.48)个]及成熟卵数[(8.36±4.56)vs.(7.88±5.01)个](P<0.01)，但受精数[(6.22±3.70)个]与优质胚胎数[(2.94±2.76)个]均显著低于常规IVF组[分别为(7.05±4.74)个、(3.40±3.03)个](P<0.05)，同时多原核(≥3PN)胚胎率(5.85%)也显著低于常规IVF组(8.26%)(P<0.01)；两组患者的种植率、临床妊娠率及流产率比较无统计学差异(P>0.05)；早期补救ICSI对首次IVF周期双原核(2PN)受精率的贡献值为4.25%，对优质胚胎率的贡献值为3.67%，对临床妊娠率的净贡献值为2.72%，总贡献值为3.49%。结论早期补救ICSI取得了和常规IVF相似的临床结局，有效提高了首次IVF周期的临床妊娠率，是针对IVF周期受精完全失败或低受精的有效治疗手段。

【关键词】ICSI；IVF；临床结局

(JReprodMed2016，25(2)：118-122)

早期补救ICSI是临床上常用的对IVF周期受精失败患者实施补救治疗的手段，IVF周期中约有5%甚至10%～25%的周期发生受精完全失败[1-2]。补救ICSI技术的应用为这些患者提供了有效的治疗措施，避免了因卵母细胞未受精导致无可用胚胎移植案例的发生。早期补救ICSI是在IVF受精4～6 h后根据第二极体是否排出作为判断卵母细胞受精与否的标准，进而对未受精或低受精的IVF周期实施补救ICSI，早期补救ICSI较晚期补救ICSI(IVF受精后22 h行补救ICSI)可获得更好的受精率及临床结局[3-4]。然而，IVF周期是否需要实施补救ICSI目前还存在争议，本文旨在通过回顾性分析的方法探讨早期补救ICSI对首次IVF周期临床结局的影响，为补救ICSI实施的临床价值提供参考数据。

材料与方法

一、研究对象与分组

收集2008年1月至2012年12月于本院生殖中心行首次IVF助孕治疗的5 029个取卵周期，常规受精4～6 h后观察第二极体有无排出，若6 h 后未排出第二极体的卵母细胞占成熟卵母细胞50%以上者实施补救ICSI，早期补救ICSI组共计413个取卵周期，常规IVF组共计4 616个取卵周期。

二、研究方法

1. 促排卵：根据患者年龄、激素水平及卵巢储备情况采用不同的促排卵方案。年龄≤35岁，激素水平及卵巢功能正常者多采用激动剂降调节的标准长方案或者改良长方案，具体方法参考我们先前的报道[5]；对于年龄较大(>35岁)，卵巢功能较差的患者多采用拮抗剂方案；其他患者，根据自身情况，采用自然周期及黄体期促排卵等方案。通过阴式B超进行卵泡监测，当1个卵泡直径达到18 mm或2个卵泡直径达到17 mm或3个卵泡直径达到16 mm时，肌肉注射HCG(珠海丽珠)5 000或10 000 U，36 h后B超引导下手术取卵。

2. 精液处理：采用密度梯度离心法处理精液，在矿物油覆盖的培养基中行常规IVF受精，精子的终浓度为0.5×105～1.0×105条/卵母细胞。

3. 卵母细胞处理：IVF受精4 h后剥除卵周颗粒细胞，并将卵母细胞移至新鲜平衡好的培养液中观察第二极体的排出情况，对于半数以上卵母细胞未排出第二极体的周期于受精6 h后再次观察，6 h后仍无改善者行补救ICSI术。

4. 胚胎发育及妊娠判断：受精18～20 h后观察卵母细胞，见原核及第二极体者为正常受精，受精后48 h及72 h分别观察胚胎发育情况，根据胚胎卵裂球数目、大小、对称性及碎片多少，并综合考虑本中心长期积累的临床经验[6]进行评分，并根据评分将胚胎分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4级。第3天细胞数目≥6个，大小均匀、对称性好，碎片<25%的Ⅰ、Ⅱ级胚胎为优质胚胎；第3天细胞数目≥4个，大小或对称性任一指标欠佳，碎片<50%的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级胚胎为可用胚胎。受精后第3天选择1～3枚胚胎移植，首选优质胚胎进行移植，无优质胚胎或者优质胚胎数目不足者选择可用胚胎移植，对于部分补救ICSI患者首选IVF受精所得胚胎移植。移植后2周抽血检测β-HCG水平，β-HCG水平阳性者于移植后4周行B超监测，B超示孕囊及胎心搏动者判定为临床妊娠。

三、观察指标

1. 对双原核(2PN)受精率的贡献值：分母：首次IVF周期获卵数(常规IVF组获卵数+早期补救ICSI组获卵数)；分子：实施早期补救ICSI术所获得的2PN胚胎数；早期补救ICSI对首次IVF周期2PN受精率的贡献值=分子/分母×100%。

2. 对优质胚胎率的贡献值：分母：首次IVF周期2PN胚胎数目(常规IVF组2PN胚胎数+早期补救ICSI组2PN胚胎数)；分子：实施补救ICSI术所获得的优质胚胎数；早期补救ICSI对首次IVF周期优质胚胎率的贡献值=分子/分母×100%。

3. 对临床妊娠率的贡献：净贡献值=分子1/分母×100%；总贡献值=分子2/分母×100%。分母：首次IVF周期移植周期数(常规IVF组移植周期数+早期补救ICSI组移植周期数)；分子1：所移植胚胎全部来自补救ICSI术所得，并获得临床妊娠的周期数；分子2：所移植胚胎至少有一个来自补救ICSI术所得，并且获得临床妊娠的周期数。

四、统计学分析

结果

一、患者基本情况比较

补救ICSI组原发性不孕患者的比例及不育年限显著高于常规IVF组，盆腔及输卵管因素患者的比例显著低于常规IVF组(P均<0.01)；两组患者年龄、体重指数、基础LH与基础E2水平无显著性差异(P均>0.05)，子宫内膜异位症及卵巢因素不孕患者比例亦无显著性差异(P均>0.05)；补救ICSI组患者基础FSH水平显著低于常规IVF组，窦卵泡数显著高于常规IVF组(P均<0.01)(表1)。

表1　两组患者基本情况比较　[(x-±s)，n(%)]

二、两组患者卵母细胞与胚胎质量比较

补救ICSI组获卵数及成熟卵数均显著高于常规IVF组(P<0.01)，但受精数与优质胚胎数均显著低于常规IVF组(P<0.05)，补救ICSI组≥3PN胚胎率显著低于常规IVF组(P<0.01)，两组患者2PN胚胎数比较无统计学差异(P>0.05)(表2)。

注：与常规IVF组比较，*P<0.01

表2　两组患者卵母细胞与胚胎质量比较 [(x-±s)，n(%)]

注：与常规IVF组比较，*P<0.05，**P<0.01

三、两组患者临床结局比较

常规IVF组移植周期数为4 039，因无可用胚胎取消移植的周期数为65，占常规IVF取卵周期的1.41%；补救ICSI组移植周期数为373，因无可用胚胎取消移植的周期数为6，占补救ICSI取卵周期的1.45%，二者比较无统计学差异(P>0.05)。两组患者移植胚胎数及子宫内膜厚度比较无显著性差异，种植率、临床妊娠率及流产率比较亦无显著性差异(P均>0.05)(表3)。

表3　两组患者临床结局比较 [(x-±s)，n(%)]

四、早期补救ICSI对首次IVF周期临床结局的贡献

本研究共纳入5 029个首次行IVF助孕治疗的周期，受精4～6 h后因半数以上卵母细胞未受精而行补救ICSI术的共有413个周期，其中206个周期因受精完全失败行全部补救ICSI，207个周期因低受精行部分补救ICSI，受精完全失败周期比例为4.1%。

早期补救ICSI对首次IVF周期2PN受精率的贡献值：1 912/(41 039+3 984)×100%=4.25%。

早期补救ICSI对首次IVF周期优质胚胎率的贡献值：1 009/(25 185+2 271)×100%=3.67%。

早期补救ICSI对首次IVF周期临床妊娠率的贡献值：分母：首次IVF周期移植周期数为4 039+373=4 412个周期；分子1：移植用胚胎全部来源于补救ICSI授精的周期共计239个，临床妊娠周期数120个；分子2：移植用胚胎至少有一个来自补救ICSI授精的周期共计314个，临床妊娠周期数154个。净贡献值：120/4 412×100%=2.72%；总贡献值：154/4 412×100%=3.49%。

讨论

IVF治疗过程中，卵母细胞与精子任何一方结构或功能缺陷都可能导致受精失败[7-8]。研究发现IVF周期中约有55%～92%的受精失败是由于精子未能正常进入卵母细胞造成的[9]，补救ICSI无疑是解决这一问题的有效手段。

本研究共纳入5 029个IVF取卵周期，最终实施补救ICSI的周期数为413个，其中206个周期受精完全失败，受精完全失败的周期比率为4.1%，与Bhattacharya等[10]的报道类似。补救ICSI组与常规IVF组比较，原发性不孕患者的比例较高，同时盆腔及输卵管因素不孕的患者比例较低，且不育年限较长，提示这组患者本身卵母细胞或者精子质量可能存在一定程度的缺陷导致常规IVF受精完全失败或低受精，最终需实施补救ICSI[11]。补救ICSI组患者基础FSH水平较低，窦卵泡数较多，并获得了较多的卵母细胞数及成熟卵数，提示补救ICSI组患者的基础条件可能优于常规IVF组，但补救ICSI组患者受精数及优质胚胎数均显著低于常规IVF组，再次提示补救ICSI组患者卵母细胞或精子质量可能存在一定程度的缺陷[2，11]。

1993年Nagy等[12]首次报道对IVF周期中受精失败的患者实施补救ICSI治疗，该研究中行补救ICSI的时间是IVF受精后22 h，即晚期补救ICSI。晚期补救ICSI常因卵母细胞老化造成ICSI受精率低、胚胎质量差而得到较差的临床结局[13-14]。早期补救ICSI术是IVF受精6 h后根据第二极体的排出情况判断卵母细胞是否受精，进而决定是否行补救ICSI，早期补救ICSI的应用大大提高了补救ICSI卵母细胞受精率及胚胎质量与临床结局[3，15]，认为其能获得和常规IVF相似的临床妊娠率[16]。然而，IVF周期受精失败患者是否需要行补救ICSI术治疗尚存在争议，反对者认为补救ICSI会增加卵母细胞3PN胚胎率[17]，可能导致异常胚胎并存在安全问题[18-19]。本研究结果发现，与常规IVF受精相比，补救ICSI授精后≥3PN胚胎比例显著低于常规IVF组。一项针对新生儿出生情况的比较研究发现，补救ICSI周期新生儿性别比例、体重、孕周、出生缺陷率、围产期死亡率等参数与常规ICSI类似[20]。近期Huang等[21]发表的一项大样本的回顾性研究发现，早期补救ICSI取得了和常规IVF/ICSI类似的临床妊娠率，且并没有显著增加新生儿的畸形率，认为早期补救ICSI是针对IVF受精失败患者安全有效的治疗手段。本研究结果同样显示早期补救ICSI组获得了与常规IVF组相似的临床结局，与之前报道[21]结果一致；此外，补救ICSI对首次IVF周期临床妊娠率的总贡献值为3.49%，净贡献值为2.72%，提示补救ICSI的实施有效避免了因无可用胚胎而取消移植案例的发生，提高了首次IVF周期总的临床妊娠率。

人类辅助生殖技术的发展已有30多年的历史，但ICSI技术对子代的安全性还有待更长时间的考证，因此临床上对ICSI的指征需要严格把控，对于无ICSI指征的患者实施IVF后出现卵母细胞受精完全失败或低受精的情况，早期补救ICSI可能是一项有效的治疗手段，其能避免因无卵母细胞受精导致无可用胚胎而取消移植案例的发生，能有效提高IVF周期总的临床妊娠率。

【参考文献】

[1]Liu DY，Baker HW. Defective sperm-zona pellucida interaction：a major cause of failure of fertilization in clinical in-vitro fertilization [J]. Hum Reprod，2000，15：702-708.

[2]Combelles CM，Morozumi K，Yanagimachi R，et al. Diagnosing cellular defects in an unexplained case of total fertilization failure [J]. Hum Reprod，2010，25：1666-1671.

[3]Chen C，Kattera S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF [J]. Hum Reprod，2003，18：2118-2121.

[4]Beck-Fruchter R，Lavee M，Weiss A，et al. Rescue intracytoplasmic sperm injection：a systematic review [J]. Fertil Steril，2014，101：690-698.

[5]任建枝，沙爱国，韩冬梅，等. 改良长方案的控制性超促排卵方案在体外受精-胚胎移植中的应用 [J]. 生殖医学杂志，2013，22：846-850.

[6]刘兰兰，蔡嘉力，李萍，等. 发生早期胚胎发育阻滞的IVF周期临床结局探讨 [J]. 生殖医学杂志，2014，23：889-893.

[7]Mahutte NG，Arici A. Failed fertilization：is it predictable? [J]. Curr Opin Obstet Gynecol，2003，15：211-218.

[8]Swain JE，Pool TB. ART failure：oocyte contributions to unsuccessful fertilization [J]. Hum Reprod Update，2008，14：431-446.

[9]Rawe VY，Olmedo SB，Nodar FN，et al. Cytoskeletal organization defects and abortive activation in human oocytes after IVF and ICSI failure [J]. Mol Hum Reprod，2000，6：510-516.

[10]Bhattacharya S，Hamilton MP，Shaaban M，et al. Conventional in-vitro fertilisation versus intracytoplasmic sperm injection for the treatment of non-male-factor infertility：a randomised controlled trial [J]. Lancet，2001，357：2075-2079.

[11]Beck-Fruchter R，Lacee M，Weiss A，et al. Rescue intracytoplasmic sperm injection：a systematic review [J]. Fertil Steril，2014，101：690-698.

[12]Nagy ZP，Joris H，Liu J，et al. Intracytoplasmic single sperm injection of 1-day-old unfertilized human oocytes [J]. Hum Reprod，1993，8：2180-2184.

[13]Kuczyński W，Dhont M，Grygoruk C，et al. Rescue ICSI of unfertilized oocytes after IVF [J]. Hum Reprod，2002，17：2423-2427.

[14]蒋晓明，沙爱国，周友泉，等. 常规IVF授精后6 h行ICSI挽救IVF受精失败的可行性分析 [J]. 中国优生与遗传杂志，2010，18：114-115.

[15]金海霞，孙莹璞，戴善军，等. 短时受精与长时受精对体外受精及临床妊娠结局的影响 [J]. 现代妇产科进展，2012，21：133-135.

[16]Huang B，Li Z，Zhu L，et al. Progesterone elevation on the day of HCG administration may affect rescue ICSI [J/OL]. Reprod Biomed Online，2014，29：88-93.

[17]Xue Y，Tong X，Jiang L，et al. Effect of cumulus cell removal 4 h post-insemination on fertilization and embryo quality：a prospective randomized sibling-oocyte study [J]. J Assist Reprod Genet，2013，30：1049-1053.

[18]Pehlivan T，Rubio C，Ruiz A，et al. Embryonic chromosomal abnormalities obtained after rescue intracytoplasmic sperm injection of 1-day-old unfertilized oocytes [J]. J Assist Reprod Genet，2004，21：55-57.

[19]Coticchio G. Polarization microscopy and rescue ICSI [J/OL]. Reprod Biomed Online，2013，26：222-223.

[20]Chen L，Xu Z，Zhang N，et al. Neonatal outcome of early rescue ICSI and ICSI with ejaculated sperm [J]. J Assist Reprod Genet，2014，31：823-828.

[21]Huang B，Qian K，Li Z，et al. Neonatal outcomes after early rescue intracytoplasmic sperm injection：an analysis of a 5-year period [J]. Fertil Steril，2015，103：1432-1437.

[编辑：肖晓辉]

Effects of early rescue ICSI on the clinical outcome in initial IVF cycles

LIULan-lan，CAIJia-li，RENJian-zhi*

ReproductiveMedicineCenter，174thHospitalofPLA，Xiamen361000

【Abstract】

Objective： To investigate the effects of early rescue ICSI on the clinical outcome of patients undergone the first cycle of IVF treatment.

Methods： The data of 5 029 cycles initially performed IVF treatment in our center from 2008 to 2012 were retrospectively analyzed. The oocyte fertilization is estimated 4-6 hours after oocyte-sperm incubation by observing discharge of the second polar body. Then the early rescue ICSI was performed for the patients with less than 50% oocytes fertilized，and the rest patients were performed conventional IVF treatment. Basic characteristics，clinical pregnancy outcome of the early rescue ICSI group(n=413) and conventional IVF group(n=4 616)were compared，and the contribution of early rescue ICSI to initial IVF cycle clinical outcomes were calculated.

Results： Compare with the conventional IVF group，the proportion of patients with primary infertility was higher and their infertility duration was longer significantly，and the proportion of patients’ infertility due to the etiology of fallopian tube or pelvic cavity was significantly lower in the rescue ICSI group (allP<0.01). Furthermore，the basic FSH level was significantly lower and antral follicle count was significantly higher in the rescue ICSI group (allP<0.01). The rescue ICSI group obtained significantly more oocytes [(9.65±5.20)vs.(8.89±5.48)] as well as mature oocytes [(8.36±4.56)vs.(7.88±5.01)](P<0.01)，but fertilized embryo number [(6.22±3.70) vs. (7.05±4.74)]，high quality embryo number [(2.94±2.76)vs. (3.40±3.03)] and the rate of ≥3PN embryo were significantly lower(5.85% vs. 8.26%)in the rescue ICSI group (P<0.01). There was no statistical difference in the clinical pregnancy rate，implantation rate and abortion rate between the two groups(P>0.05). The contribution value of early rescue ICSI for 2PN fertilization rate was 4.25%，3.67% for high quality embryo rate，and 2.72% for clincal pregnancy rate. The total contribution value was 3.49% in the initial IVF cycles.

Conclusions： Early rescue ICSI can achieve similar clinical pregnancy rate compared to conventional IVF cycles，and it can efficiently increase the total pregnancy outcome of initial IVF cycles. It is an effective method for initial IVF cycles with total failure fertilization or low fertilization rate.

Key words：ICSI；IVF；Clinical outcome

【作者简介】刘兰兰，女，山东临沂人，博士，助理研究员，生殖医学专业.(*通讯作者)

【基金项目】厦门市科技计划项目(3502Z20144039)

【收稿日期】2015-06-25；【修回日期】2015-09-08

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.2.003