哮喘患儿外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞的测定及临床意义

湛洁谊，卢慧敏，林穗玲

(1.广州医科大学附属第一医院 儿科，广东 广州510120；2.广州天河区妇幼保健院 检验科，广东 广州510610)



哮喘患儿外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞的测定及临床意义

湛洁谊1，卢慧敏1，林穗玲2

(1.广州医科大学附属第一医院 儿科，广东 广州510120；2.广州天河区妇幼保健院 检验科，广东 广州510610)

摘要：目的探讨CD4+CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞在哮喘儿童外周血中的比例改变，并探讨其临床意义。方法150例哮喘患儿按临床表现分为急性发作组(50例)、临床缓解期组(50例)和咳嗽变异性哮喘组(50例)，另选择50名健康儿童为正常对照组。应用流式细胞仪检测上述各组外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞占CD4+T细胞的百分比。结果急性发作期组患儿外周血CD4+CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞水平较缓解组、咳嗽变异性哮喘组及健康对照组明显下降(P<0.05)，而缓解期组及咳嗽变异性哮喘组与健康对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论CD4+CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞可能参与了哮喘的发生与发展，哮喘的严重程度可能与CD4+CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞的水平相关。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0078)

CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类调节或抑制其他免疫细胞功能的细胞。近年来，研究资料显示，CD4+CD25+调节性T细胞在哮喘的发病中可能起着重要作用。在过去的研究中，多数以CD25+来界定调节性T细胞，但这样得到的调节性T细胞可能会不完整，因为经免疫激活的效应性T细胞CD25的表达也会上调，导致较难区分调节性T细胞和效应性T细胞。近期研究提示CD127的低表达(CD4+CD25nt/hiCD127loTreg)能较好地反映完整的调节性T细胞。目前关于CD4+CD25nt/hiCD127loTreg与哮喘的研究不多，特别是未见咳嗽变异性哮喘与CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的研究。该文通过检测不同时期及不同类型哮喘患者外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的表达水平，探讨该细胞表达水平与哮喘发病的关系。

1资料与方法

1.1一般资料选择2010-2013年广州医科大学附属第一医院儿科门诊哮喘患者150例，均符合2008年中华医学会儿科学分会呼吸学组制定的哮喘及其分期的诊断标准[1]。急性发作期哮喘患儿50例，年龄2-9岁；临床缓解期哮喘患儿50例，年龄2.5-11岁；咳嗽变异性哮喘患儿50例，年龄3-10岁。对照组50例，为广州市天河区妇幼保健院健康体检儿童，年龄2-10岁，均无自身免疫性疾病、过敏性疾病以及肿瘤疾病史，近2个月内无感染性疾病，并除外近3个月内使用肾上腺皮质激素、免疫抑制剂或其他免疫调节剂史。各组的性别构成、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

1.2主要试剂与仪器鼠抗人的CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Alexa Fluro647及同型对照单抗，FAC lysing solution溶血素，流式细胞仪FACScanto，以上试剂及仪器均购自美国Becton Dickinson公司。分析软件为FACSDiva software。

1.3外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的检测抽取研究对象外周静脉血2 ml，用EDTA抗凝。取两支流式上样管，分别加入EDTA抗凝全血50 μl，第一管加同型对照，第二管加CD4FITC、CD25PE、CD127 Alexa Fluro647，各为10 μl，室温避光孵育15-20分钟，然后加入FASC 溶血素1 ml，混合后避光静置10分钟，1 000 r/min离心3分钟，加入2ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次，加入适量PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。以CD4阳性细胞设门，分析CD4+CD25nt/hiCD127lo调节性T细胞占CD4+T细胞的百分比。

2结果

2.1研究对象年龄、性别构成比较见表1。

表1　不同组别年龄及性别构成比较

2.2不同组别外周血中CD4+CD25nt/hiCD127loTreg占CD4+T细胞的比例比较急性发作期哮喘患儿外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg占CD4+T细胞的比例明显低于健康对照儿童、临床缓解期哮喘患儿及咳嗽变异性哮喘患儿(P<0.05)。临床缓解期哮喘患儿及咳嗽变异性哮喘患儿与健康对照儿童比较差异无统计学意义(均为P>0.05)。临床缓解期哮喘患儿与咳嗽变异性哮喘患儿比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2　不同组别外周血中CD4+CD25nt/hiCD127loTreg

注：*与急性发作组比较，P<0.05。

3讨论

CD4+CD25+Treg是CD4+T细胞的一个小的细胞亚型，具有免疫无能性和抑制性两大功能特征[2]。近年来，研究资料显示，CD4+CD25+调节性T细胞在哮喘的发病中可能起着重要作用。在过去的研究中，多数界定CD4+CD25+T细胞为调节性T细胞，但这样得到的调节性T细胞和效应T细胞有部分重叠，较难区分调节性T细胞和效应性T细胞[3]。根据CD4+T细胞表达CD25的程度不同，CD4+CD25+Treg可分为CD4+CD25hiTreg、CD4+CD25ntTreg(中等强度表达)和CD4+CD25-Treg。但具有免疫调节或抑制活性的细胞主要是中、高表达CD25+的CD4+T细胞(CD4+CD25nt/hiTreg)[4，5]。但由于对CD25nt/hh细胞设门具有主观性，使得结果难以掌握。因此CD25nt/hi表型可能会低估或高估调节性T细胞的数量。近来认为叉状头/翅膀状螺旋转录因子3(forkhead/winged helix transcription factor 3，Foxp3)是CD4+CD25+Treg细胞分化发育和功能维持的重要调控基因[6]。Foxp3主要表达于CD4+CD25highTreg，达97%左右[7]。Foxp3被认为是CD4+CD25+Treg的特异性标志物[8-11]。但由于FOXP3为核内蛋白，需要对细胞进行破膜，操作步骤繁琐，实验操作过程中影响因素较多[12]，因而限制了其临床应用。最新研究表明CD127的低表达(CD4+CD25nt/hiCD127lo)与CD25中高表达Foxp3有良好的相关性[13，14]。细胞膜表面抗原CD127是IL-7受体的一部分。CD127在效应性T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞活化后仍能持续表达，只在调节性T淋巴细胞表达下降，因此联合应用CD25中高表达和CD127低表达，能够有效去除CD25+T淋巴细胞中效应T淋巴细胞，从而反映调节型T淋巴细胞的数量。由于CD127为表面抗原，无需对胞内进行染色，操作较简单，重复性好，且可保持细胞的完整性，使染色后的细胞仍可以进行培养等进一步的研究。所以CD4+CD25nt/hiCD127loTreg是识别调节性T淋巴细胞的一个重要标记。

该实验研究表明，哮喘急性发作期患儿的外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平明显低于临床缓解期哮喘患儿、咳嗽变异性哮喘患儿和正常对照组儿童，与上官文姬[15]的报道一致，提示哮喘急性发作期患儿体内存在T调节细胞免疫功能平衡失调，导致抑制免疫功能减弱或呈低反应性，可能是引起支气管哮喘发病的机制之一。而临床缓解期哮喘患儿外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平与正常对照组比较差异无统计学意义。与上官文姬[16]的报道不一致，分歧的产生可能与疾病的状态不同有关，哮喘患儿症状缓解可能与体内CD4+CD25nt/hiCD127loTreg的水平恢复有关。同时咳嗽变异性哮喘患儿外周血CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平与正常对照组比较差异也无统计学意义。这可能与咳嗽变异性哮喘患儿的病情较轻，CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平下降不明显有关。该实验研究表明哮喘的严重程度可能与CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平相关。目前尚未见咳嗽变异性哮喘与CD4+CD25nt/hiCD127loTreg水平关系的研究报道，尚需更大量的样本验证及进一步的研究。

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关键词：哮喘；儿童；调节性T细胞；流式细胞术

The level of CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells and its clinical significance in children with asthmaZHANJie-yi,LUHui-min，LINSuiling.(DepartmentofPediatrics,FirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniviersity,Guangdong510120,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the proportion change of CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells(Treg)in peripheral blood of children withasthma and to analyze its significance.Methods150 asthmatic children were divided into three groups according to their clinicalfeatures：50 subjects in acute asthma attack group,50 subjects in clinical remission of asthma group and 50 subjects in cough variant asthma group，meanwhile,50 healthy children were enrolled in the control group.The levels of CD4+CD25nt/hiCD127loTreg in peripheral blood of all children were detected by flow cytometer.ResultsThe CD4+CD25nt/hiCD127loTreg level in acute attack group were lowest of the four groups (P<0.05),but the level in the control group was not significantly dif-ferent from the the clinical remission group and the cough variant asthma(allP>0.05).ConclusionThe CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells may be involved in the pathogenesis of asthma,The level of CD4+CD25nt/hiCD127loregulatory T cells correlated with the severity of asthma in children.

Key words:Asthma；Children；Regulatory T cell；Flow cytometry

(收稿日期：2014-11-20)

作者简介：湛洁谊(1967-)，女，广东，毕业于广州医学院，本科学历，硕士学位，主任医师，研究方向为儿童呼吸系统疾病。

文献标识码：A

中图分类号：R562.2+5

文章编号：1007-4287(2016)01-0078-03

基金项目：广东省卫生厅立项课题(A2011253)