MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔藓中的表达及相关性研究

刘长欢，金　玲，丁丽娜，陈英新

(吉林大学口腔医院VIP综合科室，吉林 长春130021)



MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔藓中的表达及相关性研究

刘长欢，金玲，丁丽娜，陈英新*

(吉林大学口腔医院VIP综合科室，吉林 长春130021)

摘要：目的检测MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔藓中的表达情况，探讨两者在扁平苔藓发病机制中的作用及相关性。方法采用免疫组化技术检测MMP-9和Fascin蛋白在35例口腔正常黏膜组织、45例口腔扁平苔藓和46例口腔鳞状细胞癌组织中的表达。应用SPPSS软件对实验结果进行卡方检验和Spearman相关分析。结果MMP-9在口腔正常黏膜组织、口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌组织中的表达依次增高，表达率分别为11.4%(4/35)、66.7%(30/45)、89.1%(41/46)，组间差别有统计学意义(P<0.05)；Fascin在口腔正常黏膜组织、口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌组织中的表达率依次增高表达率分别为0%(0/35)、15.6%(7/45)、69.6%(32/46)，组间差别具有统计学意义(P<0.05)；且MMP-9和Fascin蛋白在扁平苔藓中的表达呈正相关(r=0.427,P<0.05)。结论MMP-9和Fascin蛋白在口腔扁平苔藓癌变的进展过程中起着重要作用，两者之间起相互协同促进的作用。

(ChinJLabDiagn,2016,20:0011)

口扁平苔藓(lichen planus，LP)是一种伴有慢性浅表性炎症的黏膜角化异常性疾病，具有一定恶变潜能，其恶变率约为0.39%-3.02%[1]。研究表明[2,3]，在多种恶性肿瘤疾病中，Fascin蛋白和MMP-9均发挥重要作用，但目前尚缺乏两者在OLP中表达及相关性的报导。本课题通过用免疫组织化学法检测口腔正常黏膜组织、口腔扁平苔藓和口腔鳞状细胞癌组织中MMP-9和Fascin蛋白的表达，探讨MMP-9和Fascin蛋白的表达及相关性在口腔扁平苔藓发病中所起的作用。

1材料和方法

1.1标本来源

选取吉林大学口腔医院VIP综合科和口腔颌面外科 2011—2014年经病理科确诊的活检标本，其中45例OLP组织，46例口腔鳞癌组织，35例正常组织来源于口腔颌面外科及急诊科外伤，把甲醛溶液固定后的黏膜组织进行石蜡包埋、固定制成石蜡片，以便进行免疫组化染色，切片风化后在显微镜下观察。

1.2主要试剂

兔抗人基质金属蛋白酶9多克隆抗体，小鼠抗人Fascin蛋白单克隆抗体，pv-6000 山羊抗兔小鼠IgGHRP聚合物，TrisEDTA修复液(pH8.0)，DAB kit(20x二管)，过氧化物封闭液均购于中杉金桥试剂公司。

1.3主要设备

石蜡切片机 (德国 LEICA)、组织包埋机( 日本OLYMPUS)、光学显微镜(日本OLYMPUS)

1.4实验方法及步骤

采用免疫组化方法。石蜡块连续切片，厚度为2.5 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，蒸馏水冲洗；将切片放入Tris/EDTA修复液(pH8.0)中，高温高压修复，冷却至室温，PBS冲洗；3%H2O2室温下孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗；滴加一滴一抗(小鼠抗人Fascin蛋白单克隆抗体为成品液；兔抗人基质蛋白酶9多克隆抗体1∶200稀释)在湿盒中孵育1个 h;PBS液冲洗;滴加一滴pv-6000 山羊抗兔小鼠IgGHRP聚合物，室温孵育30 min；PBS液冲洗；DAB显色(A,B液1∶20混匀)；显微镜下观察5-7 min；苏木精复染；返蓝；梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶固封，光学显微镜观察并摄片，测定阳性细胞数。用已知的MMP-9和Fascin蛋白阳性的口腔鳞癌标本作为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.5结果评定

评分法 每张切片由2名病理科医师在显微镜下独立双盲观察结果，染色阳性以细胞浆或胞膜呈现棕黄或棕褐色为标准，按半定量方法判定其表达强度。根据细胞着色强度分为：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；每张切片随机选择10个400倍视野计算细胞总数和阳性表达的细胞个数，得出细胞表达百分率：无阳性细胞为0分，阳性细胞熟占1%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，>75%为4分。两项结果相加：0-2分为阴性，≥3分者为MMP-9阳性。

1.6统计方法

应用 SPSS20.0统计软件。各组阳性率差异比较采用行×列表χ2检验，α=0.05。

2结果

MMP-9在正常口腔黏膜大多呈阴性表达或少量表达；MMP-9在口腔扁平苔藓组织主要在上皮细胞细胞膜或胞浆中表达,阳性细胞胞浆或胞膜呈棕黄色或棕褐色;阴性细胞胞浆、胞膜不着色，胞核呈蓝紫色；MMP-9的阳性细胞在口腔鳞状细胞癌中表达显著增强，在基底膜附近的肿瘤细胞和癌巢染色更为显著，呈棕褐色，癌巢周围间质也有中等程度的染色。MMP-9在口腔正常黏膜、口腔扁平苔藓、口腔鳞癌中的表达阳性率分别为 11.4%，66.7%，89.1%，组间差别具有显著意义(P<0.05)见表1;图1-3；Fascin蛋白在口腔正常黏膜中不表达或者少量表达；在扁平苔藓Fascin主要定位在上皮基底层具有恶变潜能的基地细胞细胞质和胞膜中，呈棕黄色染色，且其染色强度明显高于正常对照组，而在口腔鳞状细胞癌中，主要表达在癌细胞的胞浆和胞膜中，尤其在癌巢的浸润边缘，表达更为明显，而鳞状细胞珠则为阴性，染色强度明显高于正常组织和扁平苔藓，其表达率分别为0%，15.6%，69.6%，组间差别具有显著意义(P<0.05),见表2，3；图4-6。

表1　MMP-9在正常口腔黏膜、口腔扁平苔藓、

注：●口腔扁平苔藓与正常组织比较；■口腔鳞状细胞癌与正常组织比较；▲口腔扁平苔藓与口腔鳞状细胞癌比较

表2　Fascin蛋白在正常口腔黏膜、口腔扁平苔藓、

注 ：●口腔扁平苔藓与正常组织比较；■口腔鳞状细胞癌与正常组织比较，；▲口腔扁平苔藓与口腔鳞状细胞癌比较

图1　MMP-9在正常组织中的表达(SPx400)　　 图2　MMP-9在扁平苔藓中的表达(SPx400)　　图3　MMP-9在鳞癌中的表达(SPx400)

图4　Fascin在正常组织中的表达(SPx400)　　图5　Fascin在扁平苔藓中的表达(SPx400)　　图6　Fascin在鳞癌中的表达(SPx400)

表3　口腔扁平苔藓中MMP-9和Fascin蛋白表达的相关性

注：Spearman等级相关性分析，MMP-9和Fascin蛋白在扁平苔藓中的表达相关系数r=0.427，P<0.05,具有统计学意义。

3讨论

口腔癌的发病机理是一个多步骤、多因素的过程，其中包括从正常黏膜到单纯增生、异常增生、原位癌最后发展成浸润癌的一个连续的病理过程。口腔扁平苔藓是临床上一种常见的口腔黏膜病，已被确切证实是一种癌前病变，其恶变率约为0.39%-3.02%,对其发病机制的研究具有重要意义。

基质金属蛋白酶家族(MMPs)是细胞外基质降解所必需的锌离子依赖性内源性蛋白酶家族，是细胞外基质的主要生理性调节物质，能够特异性的降解基底膜的成分[4]。基底膜中主要的稳定成分是Ⅳ型胶原，只有Ⅳ型胶原酶能降解IV型胶原成分，破环基底膜的完整性。MMPs家族中的明胶酶是唯一能够降解细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)中IV型胶原三螺旋结构的酶，其中MMP-9发挥最重要的作用[5]。

MMP-9少量存在于人体正常组织中，主要是恶性细胞在侵袭过程中分泌或诱导其周边间质细胞产生的MMP-9破坏基底膜，基底膜Ⅳ型胶原的降解被认为是恶性细胞侵袭转移的关键步骤，恶性细胞除了产生内源性MMP-9外，还能利用间质细胞合成MMP-9前体(酶原)，并提供合成新生物上皮细胞，因此，恶性细胞周围的间质细胞产生MMP-9也与肿瘤侵袭和转移有关[6]。大量研究已证实MMP-9在多种癌症的浸润转移中发挥重要作用[2,7]，本实验中MMP-9在正常黏膜、扁平苔藓和鳞状细胞癌表达逐渐增高，组间比较差异有统计学意义(P<0.0167)，证明口腔扁平苔藓具有一定的恶变潜能，MMP-9在扁平苔藓癌变的过程中发挥重要作用。

Fascin 蛋白属于肌动蛋白结合蛋白家族中的一员，自20世纪70年代Opassiri等[8]从海胆卵母细胞的细胞质中发现并提纯。人类Fascin基因定位于染色体7q22，最早从人类畸胎瘤中克隆，其编码一种进化相对保守的细胞骨架蛋白，定位于细胞质张力纤维和细胞膜皱褶边缘的丝状伪足、微棘的核心肌动蛋白束中[9]。研究表明，Fascin在细胞的运动，黏附以及细胞的信息交流中担任重要角色[10]。

Fascin在不同类型的细胞中表达具有差异性，在一些正常上皮组织来源的细胞中不表达或低表达，而在一些血管内皮细胞、神经胶质细胞中表达升高[11]近年来研究发现Fascin蛋白在许多上皮性肿瘤细胞中也表达上调，并与肿瘤侵袭及转移有关，大量实验研究表明Fascin蛋白的表达与肿瘤的分化增殖、细胞迁移及浸润侵袭密切相关[3,12]，Fascin蛋白在正常组织、扁平苔藓和口腔鳞癌中的表达依次增高，组间比较差异有统计学意义(P<0.0167)，表明口腔扁平苔藓具有一定的恶变潜能，Fascin蛋白在扁平苔藓癌变的过程中发挥重要作用。

综上所述，国内外对MMP-9和Fascin的研究大多局限在恶性肿瘤，本实验中MMP-9和Fascin在口腔鳞状细胞癌均成阳性表达，与文献报导结果一致[7,12]。而对其在扁平苔藓等癌前病变中的表达及相关性研究鲜有报道，研究表明MMP-9和Fascin在扁平苔藓发展为口腔鳞状细胞癌的过程中发挥重要作用，且发挥协同作用(r=0.427,P<0.05),因此以MMP-9和Fascin蛋白为靶点等分子水平治疗，可能为扁平苔藓的治疗提供新思路。但两者在OLP恶变发生发展中具体的作用机制仍需要进一步的研究。

参考文献：

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[5]柳海，李秀.口腔鳞状细胞癌中MMP-9、CD44v6表达及其意义[J].中国肿瘤，2005，14(11)：747.

[6]de Vicente JC,Fresno MF,Villalain L,et al.Expression and clinical significance of matrix metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 in oral squamous cell carcinoma[J].Oral Oncol,2005,41(32):283.

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关键词：口腔扁平苔藓；MMP-9 ；Fascin蛋白；免疫组化

Expression and correlation of MMP-9 and Fascin in oral lichen planusLIUChang-huan,JINLing,DINGLi-na,etal.(DepartmentofVIP,StomatologyHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo examine the expression and correlation of MMP-9 and Fascin in oral lichen planus(OLP).MethodsThe expression of MMP-9 and Fascin in 35 cases of normal oral mucosa,45 cases of oral lichen planus and 46 cases of oral squamous cell carcinoma(OSCC) was examined by immunohistochemical technique.The data was analyzed by SPSS,a exact test using software package.Resultsthe expression of MMP-9 in normal oral mucosa,oral lichen planus and oral squamous cell carcinoma rises in turn.The positive rate respectively is 11.4%(4/35)、66.7%(30/45)、89.1%(41/46)，the comparison among groups is statistically significant(P<0.05);The expression of Fascin in normal oral mucosa,oral lichen planus and oral squamous cell carcinoma rises in turn.The positive rate respectively is 0%(0/35)、15.6%(7/45)、69.6%(32/46),the comparison among groups is statistically significant(P<0.05);In oral lichen planus,the expression of MMP-9 is positively correlative with that of Fascin(P<0.05).ConclusionMMP-9 and Fascin not only respectively paly an important role in cancerous progress of oral lichen planus but also the two factor work together to promote the cancerous progress.

Key words:oral lichen planus;MMP-9;Fascin;immunohistochemistry

(收稿日期：2015-03-10)

作者简介：刘长欢(1989-)，男，吉林大学口腔医学院研究生；陈英新，教授，硕士生导师，研究方向：口腔黏膜病。

文献标识码：A

中图分类号：R446.62

文章编号：1007-4287(2016)01-0011-04

*通讯作者