非洲加纳籽乙醇提取物的生物活性研究

郑志忠,谌　迪,刘韶松,明艳林

(1.华侨大学化工学院，福建 厦门 361021；

2.厦门华侨亚热带植物引种园 药用植物与植物药研发中心，福建 厦门 361002)



非洲加纳籽乙醇提取物的生物活性研究

郑志忠1,2,谌迪2,刘韶松2,明艳林1,2

(1.华侨大学化工学院，福建 厦门 361021；

2.厦门华侨亚热带植物引种园 药用植物与植物药研发中心，福建 厦门 361002)

摘要：采用MTT法研究了非洲加纳籽乙醇提取物的抗肝癌活性，并研究了其对DPPH自由基的清除能力。结果表明，加纳籽95%乙醇提取物对肝癌细胞SMMC7721和Bel7402具有较好的抑制活性，IC50值分别为(124.05±11.35) μg·mL-1和(157.05±3.94) μg·mL-1；不同浓度乙醇提取的加纳籽乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力均明显强于Vc。该研究可为非洲加纳籽的生物活性研究及生物活性成分的分离提供参考。

关键词：非洲加纳籽；乙醇提取物；生物活性；DPPH自由基

非洲加纳籽(Griffonia simplicifoliaBaill.)，属于豆科、云实亚科、加纳籽属的灌木植物，原产于加纳、象牙海岸、科特迪瓦和多哥等西非国家[1-2]。在西非地区，加纳籽有着悠久的民间药用史。其叶和叶汁可分别用来治疗外伤及与膀胱和肾脏相关的疾病；此外，加纳籽还可以用来治疗腹泻、呕吐、胃痛；而最广为人知的则是其抗菌和激发性欲的特性[3]。近年来研究发现，加纳籽的主要活性成分是5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan，5-HTP)。5-HTP是一种氨基酸类物质，也是抑制性神经递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)的前体物质，能提高脑部5-HT浓度、抑制忧郁、促进褪黑素合成、改善睡眠质量等。然而5-HTP的分布范围窄，目前发现仅在加纳籽中有大量存在。鉴于5-HTP的良好活性，近年来，5-HTP在美国、英国和加拿大被当作膳食补充剂销售；我国对此类药物的需求量也在不断增加。由于非洲加纳籽资源有限，加之大量的采集和物流成本的不断增加，致使5-HTP的生产成本居高不下。为了更好地可持续利用这一植物种质资源，在我国热带和南亚热带地区引种驯化这一物种就显得尤为重要。

作者在此以加纳籽为原料，研究了加纳籽乙醇提取物的抗肝癌和清除DPPH自由基的活性，以期为后续分离纯化加纳籽中的活性成分奠定基础。

1实验

1.1　试剂与仪器

加纳籽、5-HTP，天医堂(厦门)生物工程有限公司；肝癌细胞SMMC7721、Bel7402，中国科学院细胞库；二苯基苦基苯肼(DPPH)、四甲基偶氮唑盐(MTT)，Sigma公司；DMEM、RPMI1640细胞培养基，Gibco公司；新生牛血清，HyClone公司；青霉素钠、链霉素钠，Sangon公司；其它试剂均为国产分析纯。

N-1200BV-WD型旋转蒸发仪，EYELA；UV-2802H型紫外可见分光光度计，Unico；超纯水机，Pallcorporation；MODULYOD-230型冷冻干燥机、MULTISKANMK3型酶标仪，Thermo。

1.2　方法

1.2.1加纳籽乙醇提取物的制备及TLC分析

分别称取4份300g加纳籽粉末于三角瓶中，依次加入5倍量25%、50%、75%、95%乙醇溶剂，50 ℃下水浴浸提12h，抽滤，浓缩提取液，获得加纳籽乙醇提取物。

取50g加纳籽用15倍量蒸馏水于80 ℃下浸提2h，共提取2次，提取液经抽滤浓缩至40mL(生药量为1.25g·mL-1)后用4倍量无水乙醇搅拌均匀，静置4h后，1 500×g离心2次，弃去沉淀，上清液浓缩至干得样品1。将残渣用4倍量95%乙醇于60 ℃浸提24h后, 经抽滤浓缩至干得样品2。

取50g加纳籽直接用4倍量95%乙醇于60 ℃浸提24h后, 经抽滤浓缩至干得样品3。

取样品1、2、3用适量甲醇溶解后，分别以石油醚∶乙酸乙酯=2∶1、正丁醇∶水∶乙酸=12∶5∶3为展开剂、碘熏为显示剂进行TLC分析。

1.2.2MTT法测定加纳籽乙醇提取物的抗肝癌活性

取对数生长期的肝癌细胞SMMC7721和Bel7402，经0.25%的胰酶消化，配制成5×104个·mL-1的单细胞悬液，每孔100 μL(空白组不接种细胞)接种于96孔板；37 ℃、5%CO2培养24h后，分别用180 μL的对照组培养液和含不同浓度(6.25 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1)的加纳籽乙醇提取物的样品组培养液替换，每组重复3次；培养72h后，每孔加入20 μL0.5mg·mL-1的MTT；再培养4h，弃去培养基，加入150 μLDMSO溶液振荡10min后，测定492nm处的吸光度(A)，并按式(1)计算细胞抑制率。

(1)

1.2.3DPPH自由基清除实验

参照文献[4-7]的方法，将样品用DMSO溶液配制成不同浓度(0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、10 mg·mL-1、20 mg·mL-1、40 mg·mL-1)溶液，备用。另配制pH值5.6的0.1 mol·L-1醋酸缓冲液和3 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液，避光保存。将紫外可见分光光度计用醋酸缓冲液调零，取1.0 mL醋酸缓冲液、1.8 mL无水乙醇溶液及0.1 mL DPPH乙醇溶液混匀，再加入0.1 mL样品液(空白组添加0.1 mL的DMSO溶液)混匀，30 ℃下避光保存20 min后，测定517 nm处吸光度(A)，重复3次，按式(2)计算自由基清除率。

(2)

1.3　统计学分析

2结果与讨论

2.1　加纳籽乙醇提取物的化学成分分析

以晒干的加纳籽为原料，分别用25%、50%、75%、95%乙醇溶剂提取，提取液浓缩至干，收率依次为2.05%、20.51%、6.26%、3.15%。从收率来看，50%乙醇提取物最高，25%乙醇提取物最少。加纳籽乙醇提取物的TLC如图1所示。

由图1可知，5-HTP、样品1~3用小极性展开剂展开后发现其化学成分较少(图1a)；而用较大极性展开剂展开后发现其主要化学成分为5-HTP，其它成分较少(图1b)。

2.2　加纳籽乙醇提取物的抗肝癌活性

采用MTT法测定不同浓度的加纳籽乙醇提取物对肝癌细胞SMMC7721和Bel7402的体外抑制效果，结果见表1。

由表1可知，95%乙醇提取物对SMMC7721和Bel7402均有较好的抑制作用，对肝癌细胞半数抑制浓度(IC50)分别为(124.05±11.35)μg·mL-1和(157.05±3.94)μg·mL-1，明显好于5-HTP，而其它提取物抑制效果均不明显。该结果表明，加纳籽95%乙醇提取物中可能存在其它对肝癌细胞有较高抑制率的化学成分，也可能是其它化学成分对肝癌细胞产生了协同抑制效应。

1~4.5-HTP、样品1、样品2、样品3

Fig.1 TLC Analysis of ethanol extracts from

GriffoniasimplicifoliaBaill.

表1加纳籽乙醇提取物对肝癌细胞SMMC7721

和Bel7402的IC50

Tab.1IC50of ethanol extracts fromGriffoniasimplicifolia

Baill. on hepatoma cell SMMC7721 and Bel7402

2.3　加纳籽乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力(表2)

表2加纳籽乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力

Tab.2　DPPH Free radical scavenging capacity of

由表2可知，加纳籽25%、50%、75%、95%乙醇提取物、5-HTP及阳性对照Vc对DPPH自由基均有较好的清除能力，IC50分别为(0.18±0.14) mg·mL-1、(0.35±0.15) mg·mL-1、(0.28±0.07) mg·mL-1、(0.15±0.07) mg·mL-1、(6.06±2.37) mg·mL-1、(0.53±0.30) mg·mL-1，加纳籽乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力比阳性对照Vc要强，说明加纳籽中存在自由基清除能力强的化学成分。虽有文献[8]报道5-HTP具有一定的抗氧化性，但在本实验中其对DPPH自由基清除能力并不明显，可见加纳籽中存在其它对DPPH自由基有较高清除能力的化学成分，有待进一步研究。

3结论

以非洲加纳籽为原料，通过MTT法研究了其乙醇提取物的抗肝癌活性及对DPPH自由基的清除能力。结果表明，加纳籽95%乙醇提取物对肝癌细胞SMMC7721和Bel7402具有较好的抑制活性，IC50值分别为(124.05±11.35) μg·mL-1和(157.05±3.94) μg·mL-1；不同浓度乙醇提取的加纳籽乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力均明显强于Vc。该研究可为非洲加纳籽的生物活性研究及生物活性成分的分离提供参考。

参考文献：

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[3]CARNEVALE G,di VIESTI V,ZAVATTI M,et al.Anxiolytic-like effect ofGriffoniasimplicifoliaBaill.seed extract in rats[J].Phytomedicine,2011,18(10):848-851.

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Bioactivity of Ethanol Extracts fromGriffoniaSimplicifoliaBaill.

ZHENG Zhi-zhong1,2,CHEN Di2,LIU Shao-song2,MING Yan-lin1,2

(1.CollegeofChemicalEngineering,HuaqiaoUniversity,Xiamen361021,China;

2.TheResearchandDevelopmentCenterforMedicinalPlantsandPlantDrugs,

XiamenOverseasChineseSubtropicalPlantIntroductionGarden,Xiamen361002,China)

Abstract：The anti-hepatoma activities of different concentration of ethanol extracts from Griffonia simplicifolia Baill. were measured by MTT assay,and DPPH free radical scavenging capacity of ethanol extracts from Griffonia simplicifolia Baill. were studied as well.Results showed that 95% ethanol extract from Griffonia simplicifolia Baill. had good inhibitory activity on hepatoma cell SMMC7721 and Bel7402,with half-inhibition concentration(IC50) of (124.05±11.35) μg·mL-1and (157.05±3.94) μg·mL-1,respectively.This study may provide references for bioactivity research and bioactive ingredients separation of Griffonia simplicifolia Baill..

Keywords：Griffonia simplicifolia Baill.;ethanol extract;bioactivity;DPPH free radical

中图分类号：R 284.2

文献标识码：A

文章编号：1672-5425(2016)01-0033-03

通讯作者

作者简介：郑志忠(1984-)，男，福建莆田人，助理研究员，主要从事天然产物抗肿瘤活性研究；：明艳林，研究员，博导，E-mail：xmyanlin@gmail.com。

收稿日期：2015-07-31

基金项目：厦门市科技惠民计划资助项目(3502Z20154083)

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.008