高压氧对脑外伤大鼠脑内兴奋性氨基酸水平的影响

贺仕清 邹云龙 雷北平

·基础研究·

高压氧对脑外伤大鼠脑内兴奋性氨基酸水平的影响

贺仕清1邹云龙1雷北平2

目的研究高压氧对脑外伤大鼠脑内兴奋性氨基酸水平的影响。方法通过制作大鼠脑外伤模型，设计随机实验分组：模型对照组、高气压组、高浓度氧组和高压氧组给予脑外伤大鼠治疗；同时设空白对照组。分别于第3天、第6天、第9天取大鼠全脑测量谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）的含量。结果大鼠脑损伤后脑组织中Glu、Asp含量明显升高，高压氧可明显下调Glu、Asp含量，与模型对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），而高气压组、高浓度氧组不能明显抑制Glu、Asp表达，与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论高压氧可以显著抑制脑外伤大鼠脑组织中兴奋性氨基酸释放从而减轻脑外伤后继发性脑损害，而高气压、高浓度氧不能明显抑制兴奋性氨基酸的释放。

脑损伤；兴奋性氨基酸；高压氧治疗

脑外伤是临床常见急症之一。脑外伤后有关脑组织继发性损害的机制存在多种学说[1]：其中兴奋性氨基酸（excitatory amino acids，EAA）的毒性作用是脑外伤继发性脑损伤重要的致伤机制之一[2]；EAA主要是谷氨酸（glutamic acid，Glu）和天冬氨酸（aspartic acid，Asp）。近年来国内外学者对高压氧（hyperbaric oxygen，HBO）治疗脑缺血进行了广泛的研究，且动物实验多数显示HBO有一定疗效，但对其作用的机制尚不清楚[3]。本研究探讨HBO在治疗脑外伤大鼠中对抗兴奋性氨基酸的兴奋性神经毒性和改善预后方面的作用，为HBO在临床治疗脑外伤的应用提供实验依据。

材料与方法

一、实验动物

Wister大鼠98只，体质量280 g左右，SD大鼠购买于武汉大学动物部。随机设空白对照组动物18只与模型对照组对照。

二、模型动物

用5%水化氯醛腹腔注射麻醉 （300 mg/kg体重），用BIM-Ⅲ型撞击机撞击头部（头部固定），重量800 g，高度30 cm，制作重型脑外伤动物模型。

三、实验分组

取存活动物90只，按随机数字表随机分组设空白对照组、模型对照组、高气压组、高浓度氧组和高压氧组，每组18只。各组标记。

四、分组处理

高压氧组大鼠置于高压氧舱内1次/d，纯氧洗舱5 min，升压10 min至0.1 MPa（2 ATA）后稳压，吸纯氧60 min，稳压时保证舱内氧浓度为（85±5）%，减压10 min出舱，总时间为85 min。高气压组大鼠置于高压氧舱内1次/d，空气洗舱5 min，氮气升压（不改变舱内氧分压）10 min至0.1 MPa（2 ATA）后空气稳压60 min，减压10 min出舱。高浓度氧组大鼠置于高压氧舱内1次/d，不升压，纯氧洗舱85 min。模型对照组大鼠制作脑外伤模型后不再做处理。空白对照组不做处理，与模型对照组对照。

分别于第3天、第6天和第9天在各组中随机断头处死每组6只大鼠，取脑组织称重后，按20 mg/ml加入5%三氯醋酸，在冰浴下用玻璃组织匀浆机匀浆10 min，在0～4℃下以15 000 r/min离心15 min，去除蛋白，取上清液-20℃保存，待测。

五、高效液相色谱仪检测兴奋性氨基酸含量

40 μl氨基酸样品加入100 μl氟化乙醛反应液振荡15 s后25℃放置反应2 min，进样20 μl，采用线性梯度洗脱，结果用色谱工作站处理 （外标法定量：先将标准品进行色谱分析，求得含量与色谱峰面积或峰高的关系，并将此关系绘制成定量校准曲线，然后将样品进行色谱分析，根据其对应的峰面积或峰高求出样品中的组分含量）。

六、统计学分析

结果

一、随机分组的SD大鼠体重

五组SD大鼠的平均体重进行了单因素方差分析，经统计分析五组大鼠平均体重差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 五组SD大鼠平均体重比较（±s）

表1 五组SD大鼠平均体重比较（±s）

F=2.709，P=0.086

组别 例数 平均体重（g）空白对照组 18 273±4.09模型对照组 18 278±5.16高气压组 18 272±5.24高浓度氧组 18 266±4.63高压氧组 18 270±3.98 F值 2.709 P值 ＞0.05

二、EAA在脑外伤大鼠脑内的表达

本研究用Glu和Asp结果作为兴奋性氨基酸的代表。分别于第3天、第6天和第9天时在各组中随机断头处死6只SD大鼠。空白对照组、模型对照组、高气压组、高浓度氧组和高压氧组组大鼠脑中EAA含量如表2～4所示。结果显示：与空白对照组比较（第3天、第6天、第9天），大鼠脑损伤后其脑组织中Glu和Asp含量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与模型对照组比较（第3天、第6天、第9天），经高气压、高浓度氧处理后氨基酸含量均有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），经高压氧处理后显著性下降，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表2、表3、表4）。

表2 脑外伤SD大鼠第3天脑内谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

表2 脑外伤SD大鼠第3天脑内谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

与空白对照组比较：cP＜0.05、eP＜0.05、gP＜0.05、iP＜0.05、dP＜0.05、fP＜0.05、hP＜0.05、jP＜0.05；与模型对照组比较：eP＞0.05、gP＞0.05、fP＞0.05、hP＞0.05，而iP＜0.05、jP＜0.05；与高气压组比较：gP＞0.05、hP＞0.05，而iP＜0.05、jP＜0.05；与高浓度氧组比较：iP＜0.05、jP＜0.05

兴奋性氨基酸水平谷氨酸 天冬氨酸空白对照组 6 3 2.65±0.29a 1.05±1.02b模型对照组 6 3 13.72±2.27c 5.15±1.54d高气压组 6 3 12.34±1.95e 5.01±1.77f高浓度氧组 6 3 12.56±2.51g 4.98±1.82h高压氧组 6 3 4.43±1.53i 2.03±1.05jF值 45.48 10.44 P值 ＜0.01 ＜0.01实验分组 标本例数处理时间（d）

表3 脑外伤SD大鼠第6天脑内谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

表3 脑外伤SD大鼠第6天脑内谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

与空白对照组比较：mP＜0.05、oP＜0.05、qP＜0.05、sP＜0.05、nP＜0.05、pP＜0.05、rP＜0.05、tP＜0.05；与模型对照组比较：oP＞0.05、qP＞0.05、pP＞0.05、rP＞0.05，而sP＜0.05、tP＜0.05；与高气压组比较：qP＞0.05、rP＞0.05，而sP＜0.05、tP＜0.05；与高浓度氧组比较：sP＜0.05、tP＜0.05

兴奋性氨基酸水平谷氨酸 天冬氨酸空白对照组 6 6 2.95±0.47k 1.54±1.38l模型对照组 6 6 14.28±2.67m 5.63±1.07n高气压组 6 6 13.94±2.56o 5.81±1.49p高浓度氧组 6 6 13.55±1.63q 5.43±1.99r高压氧组 6 6 4.72±1.21s 2.74±1.67tF值 51.58 9.58 P值 ＜0.01 ＜0.01实验分组 标本例数处理时间（d）

表4 脑外伤SD大鼠第9天脑内谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

表4 脑外伤SD大鼠第9天脑内谷氨酸和天冬氨酸的含量（μmol/L，±s）

与空白对照组比较：wP＜0.05、yP＜0.05、#P＜0.05、*P＜0.05、xP＜0.05、zP＜0.05、$P＜0.05、**P＜0.05；与模型对照组比较：yP＞0.05、#P＞0.05、ZP＞0.05、SP＞0.05，而*P＜0.05、**P＜0.05；与高气压组比较：#P＞0.05、$P＞0.05，而*P＜0.05、**P＜0.05；与高浓度氧组比较：*P＜0.05、**P＜0.05

兴奋性氨基酸水平谷氨酸 天冬氨酸空白对照组 6 9 3.17±0.82u 2.25±1.92v模型对照组 6 9 15.33±1.86w 1.37±1.98x高气压组 6 9 14.25±2.71y 7.31±1.64z高浓度氧组 6 9 13.55±2.03# 5.69±1.86$高压氧组 6 9 4.84±1.95* 2.44±1.81**F值 51.07 11.47 P值 ＜0.01 ＜0.01实验分组 标本例数处理时间（d）

讨论

脑外伤是临床常见急症之一。脑外伤后有关脑组织继发性损害的机制，也存在很多说法[1]：（1）EAA的毒性作用；（2）代谢过程的改变（包括高能量代谢、高分解代谢、糖耐受性降低等）；（3）单胺类神经递质的改变（去甲肾上腺素、多巴胺及5-羫色胺等）；（4）神经肽的改变(神经降压素及生长抑素等）；（5）内环境水、电解质的改变（Ca2+超载）[4]；（6）氧自由基等。其中EAA是脑外伤继发性脑损伤重要的致伤机制之一[2]。

从表2～4可以看出EAA（Glu、Asp）在大鼠正常脑组织中低表达，但在脑外伤后脑组织中明显高表达，随着受伤时间的延长EAA较受伤第3天、第6天高呈稍高表达；经高气压、高浓度氧处理后第3天、第6天、第9天较模型对照组比较，EEA表达有所降低，但高气压组、高浓度氧组与模型对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。经高压氧处理后第3天、第6天、第9天与空白对照组、模型对照组、高气压组、高浓度氧组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。高压氧能有效抑制脑外伤大鼠脑内EEA在释放；高压氧组与空白对照组比较发现不能完全抑制EEA达到正常脑组内EEA的水平；研究已经证明：脑外伤后脑缺血、氧氧和糖源供应不足，腺苷三磷酸生成减少，诱导神经元和神经胶质细胞去极化，使突触前膜电压依赖性Ca2+通道开放，Glu大量释放到突触间隙；另外突触前膜由于能量缺乏，对Glu的重摄取受到抑制，进一步增加了细胞外Glu的堆积。大量的Glu激活突触后膜N-甲基-D-天冬氨酸受体，引起Ca2+大量内流，导致细胞内Ca2+超载，并启动一系列神经细胞损伤的病理反应，如激活Ca2+依赖性蛋白溶解酶、核酸内切酶、磷脂酶、一氧化氮合酶等。其中激活的蛋白溶解酶能降解细胞骨架；激活的磷脂酶A2和环氧合酶可催化产生氧自由基，引起炎症反应和细胞凋亡；激活的一氧化氮合酶催化产生过量的一氧化氮，能与超氧阴离子形成过氧亚硝酸根离子和轻自由基，损伤线粒体膜，使线粒体形成漏洞，开放线粒体转换孔，致使离子平衡紊乱[5]；大量的Glu激活代谢型Glu受体，从而激活了与Ca2+蛋白相偶联的磷脂酞肌醇信号转导途径，最终导致细胞通透性发生改变，使大量的Na+和C1-进入细胞内，水被动进入胞内引起细胞肿胀，诱导细胞坏死和凋亡[6]。因此，在脑损伤的过程中EAA的神经毒性作用既是损伤脑组织的启动者又是执行者[7]。

通过研究已证实的EAA兴奋性神经毒性机制与目前高压氧治疗脑外伤的作用机制，高压氧抑制EAA释放改善神经功能及愈后的机理推测如下：（1）高压氧可以提高血氧含量及氧分压，使血氧弥散能力增强，改善缺血部位周围组织氧的供给[8]，可抑制突触前膜电压依赖性Ca2+通道过度开放，从而抑制Glu大量释放到突触间隙；另外，改善突触前膜能量缺乏，可改善Glu的重摄取，进一步减轻细胞外Glu的堆积；最终挽救半暗带区的细胞，对缺血脑组织起到极大保护作用，最终降低死亡率和致残率。（2）高压氧抑制大量的Glu释放，因此未能激活代谢型Glu受体，从而抑制与Ca2+蛋白相偶联的磷脂酞肌醇信号转导途径，最终稳定细胞通透性，使大量的Na+和C1-未能进入细胞内，缓解细胞肿胀，最终减轻细胞坏死和凋亡。此外，高压氧有a-肾上腺素样的作用，可使脑血管收缩，脑血流量减少，阻断脑缺氧、脑水肿的恶性循环，从而降低颅内压，减轻脑水肿[9]。高压氧可促进血管再生和侧枝循环的建立，改善局部循环，减轻局部脑水肿；降低血液粘滞度，抑制血栓形成，从而改善脑的微循环和血液灌注[10]；减少中性粒细胞浸润[11]，提高脑组织清除氧自由基的能力，降低细胞免受损害[12]。由此联系临床：早期应用高压氧对颅脑损伤具有明显疗效；重症颅脑损伤昏迷患者的最佳治疗时机是创伤后7～30 d[13]；应严格掌握人舱治疗指征，适当的时间段给予适量的高压氧治疗，否则容易产生高压氧中毒[14]。治疗过程中监测颅内压、脑灌注压、脑血流量、脑组织氧分压和脑温等[15]。本研证实高压氧能有效抑制EAA的释放，从而减轻EAA的神经兴奋性毒性作用对神经细胞的损伤；高气压、高浓度氧不能有效抑制EAA的释放。高压氧能有效抑制EAA的释放的确切分子机制有待于进一步研究。

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Effects of hyperbaric oxygen on the level of excitatory amino acids in the brain of rats with brain injury

He Shiqing1,Zou Yunlong1,Lei Beiping2.1Department of Neurosurgery,Affiliated Nanhua Hospital of South China,Hengyang 421002,China;2Department of Neurosurgery,169 General Hospital of Chinese PLA,Hengyang 421002,China

Zou Yunlong,Email:13973422100@139.com

ObjectiveTo study the effect of hyperbaric oxygen on the level of excitatory amino acids in the brain of rats with brain injury.MethodsBy making the models of traumatic brain injury in rats and design randomized experimental group:model control group,high pressure group,high concentration oxygen group and hyperbaric oxygen group were treated with brain injury rats.The contents of glutamic acid（Glu)and aspartate（Asp)were measured in rats at third days,sixth days and ninth days respectively.The contents of glutamic acid（Glu)and aspartate（Asp)were measured in rats at third days,sixth days and ninth days respectively.ResultsThe content of Glu and ASP in the brain tissue of rats with brain injury increased significantly and hyperbaric oxygen can be significantly reduced content of Glu and ASP.Compared with model control group,there were significant differences（P＜0.05).The high pressure group and high concentration oxygen group could not significantly inhibit the expression of Glu and Asp.Compared with the model group had no significant difference（P＞0.05).ConclusionHyperbaric oxygen can significantly inhibit the release of excitatory amino acids in brain tissue of rats with traumatic brain injury and reduce the secondary brain damage after traumatic brain injury,while high pressure,high concentration of oxygen can not significantly inhibit the release of EAA.

Cerebral injury;Excitatory amino acids；Hyperbaric oxygen therapy

2016-04-30）

（本文编辑：张丽）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2016.05.007

湖南省卫生厅一般项目（B2010-056)

421002 衡阳，南华大学附属南华医院神经外科1；421002 衡阳，中国人民解放军第一六九总医院高压氧科2

邹云龙，Email：13973422100@139.com

贺仕清,邹云龙,雷北平.高压氧对脑外伤大鼠脑内兴奋性氨基酸水平的影响[J/CD].中华神经创伤外科电子杂志,2016,2(5): 289-292.