木蝴蝶不同极性组分体外抗氧化活性研究

2016-02-24熊汝琴张泽俊

昭通学院学报 2016年5期

关键词：木蝴蝶极性光度

王锐，师睿，熊汝琴，张泽俊

(昭通学院化学与生命科学学院，云南昭通 657000)

●化学与环境资源研究

木蝴蝶不同极性组分体外抗氧化活性研究

王锐，师睿，熊汝琴，张泽俊

(昭通学院化学与生命科学学院，云南昭通 657000)

木蝴蝶；不同极性组分；自由基；多酚；黄酮

自由基是生物体氧化过程中产生的正常中间代谢产物，具有强氧化性，若在体内过量堆积就会引发一系列自由基反应，引起脂质、蛋白质分子交联沉积，损伤细胞膜，导致重要的酶失活，DNA突变，进而引起慢性疾病及衰老等各种效应[1-2].为了减轻自由基的危害，寻找高效、安全的天然抗氧化剂，筛选具有抗自由基的物质，意义重大.

1 仪器与材料

1.1 仪器

ZKF035真空干燥箱 (上海实验仪器厂有限公司)； XFB-200家用粉碎机(吉首巿中湘制药机械厂)；AF1604型电子天平(上海天平仪器厂)；RE-5298旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SK5200LHC超声波洗涤器(上海科导超声仪器有限公司)；UV/VIS2802PCS紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)；HH-S601超级恒温水浴锅(金坛市岸头良友实验仪器厂).

1.2 材料

生物木蝴蝶(云南省丽江市)；芦丁对照品(中国药品制品检定所)；没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所)；福林酚试剂(Sigma公司)；1,1-二苯-2-苦肼自由基(DPPH·,Sigma公司)；其余试剂均为分析纯.

2 试验方法

2.1 木蝴蝶不同极性组分的制备

木蝴蝶经干燥粉碎，过60目筛，加入20倍体积石油醚，超声(30KHZ，250W)浸提0.5h，除去其中的脂类、色素等成分，抽滤、晾干回收粉末.按料液比1:40，在上述粉末中加入体积分数80%乙醇，超声(53KHZ，250W)浸提1h ，过滤，滤渣同上重复浸提至溶液无色，合并滤液，减压浓缩，得木蝴蝶醇提物(EO).将所得EO加入去离子水制成悬浮液，依次用乙酸乙酯、正丁醇和去离子水萃取，萃取所得各相经减压浓缩蒸干后得到木蝴蝶不同极性组分：乙酸乙酯萃取组分(EAO)、正丁醇萃取组分(n-BO)和水萃取组分(WO).取适量上述萃取组分按实验要求配制成不同质量浓度的供试溶液.

2.2 木蝴蝶不同极性组分的体外抗氧化试验

2.2.1 ·OH清除试验

先在试管中加入不同质量浓度供试溶液2mL，然后加入9mmol·L-1FeSO4溶液2mL和9 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液2mL，摇匀，最后加入8.8mmol·L-1H2O2溶液2mL，混匀，置于37℃水浴反应30min后取出，冷却至室温，在510nm波长处吸光度值[7].以乙醇代替不同样品溶液为空白对照，维生素C(Vc)为阳性对照，每种样品重复测定3次，求平均值，依据下列公式计算清除率(以下均同).

Ao为空白对照溶液的吸光度值，Ax为加入供试溶液后的吸光度值，Axo为供试溶液的本底吸光度值.

取0.05 mol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH=8.2)5mL于试管中，加入4mL供试溶液，置于25 ℃水浴中预热20min，再加3mmol·L-1邻苯三酚溶液1mL，混匀，于25℃水浴中准确反应4min后迅速加入10mmol·L-1HCl溶液1 mL终止反应，在波长320nm处测吸光度值[8]，并计算清除率.

2.2.3 DPPH·清除试验

参照文献[9-10]，用无水乙醇精确配制1×10-4mol·L-1的DPPH·溶液.取此溶液2mL加入供试样品溶液2mL，均匀混合，于黑暗中放置30min，在517nm波长处测定其吸光度值，计算清除率.

2.3 不同极性组分中生物活性成分含量测定

2.3.1 不同极性组分中多酚含量测定

对照文献[11]配制没食子酸标准液，于765nm 波长处测定吸光值，绘制吸光度值与没食子酸标准液的工作曲线.精确量取0.5mL质量浓度均为1mg·mL-1的EAO、n-BO和WO的供试液于25mL比色管中，补充5mL去离子水，加入1.5mL，1mol·L-1福林酚试剂，摇匀，放置2min；然后，加入3mL质量分数为10%的Na2CO3溶液，最后加入去离子水定容至25mL，摇匀，放入30℃水浴中，反应30min后取出，冷至室温，于765nm波长处测吸光度值.对照没食子酸标准曲线，通过线性方程计算出样品中多酚含量.

2.3.2 不同极性组分中黄酮含量测定

在参照文献[12]的基础上有所改变.配制芦丁标准液，采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法，在510nm波长处测定吸光度值，得到吸光度值与芦丁标准液的关系曲线.精确量取1.5mL质量浓度均为5mg·mL-1的EAO、n-BO和WO的供试液于25mL比色管中，加入质量分数为5%的NaNO2溶液1mL，摇匀，放置6min；再加入质量分数为10%的Al(NO3)3溶液1mL，摇匀，放置6min；最后加入质量分数为2%的NaOH溶液10mL，用体积分数为50%乙醇定容至刻度，摇匀，放入40℃水浴中，反应30min，冷至室温，于510nm波长处测吸光度值.通过芦丁标准曲线方程计算出样品中黄酮含量.

3 结果与分析

3.1 对·OH的清除作用

木蝴蝶不同极性萃取组分EAO、n-BO、WO和Vc对·OH的清除作用如图1所示.

木蝴蝶各极性组分对·OH 都有较强的清除作用.在试验浓度范围内，均表现出剂量依赖性清除.

图1 木蝴蝶不同极性组分对·OH的清除作用Fig. 1 Scavenging effect of different polar fractions of Oroxylum indicum Vent. on ·OH

图1经计算机线性拟合计算出Vc、EAO、n-BO和WO对·OH的IC50值(表1)，说明各极性组分中，EAO对·OH的清除效果略低于Vc，而显著高于另外两个极性组分，其清除·OH的能力约是n-BO的7倍，WO的14倍.

图2 木蝴蝶不同极性组分对的清除作用Fig. 2 Scavenging effect of different polar fractions of Oroxylum indicum Vent. on

3.3 对DPPH·的清除作用

测定木蝴蝶不同极性组分对DPPH·的清除作用，如图3所示.

图3 木蝴蝶不同极性组分对DPPH·的清除作用Fig. 3 Scavenging effect of different polar fractions of Oroxylum indicum Vent. on DPPH·

木蝴蝶不同极性组分对DPPH·均具有较强的清除能力.试验浓度范围内，存在的良好的剂量依赖性，但不同极性组分清除DPPH·能力不同.由表1可见，EAO对DPPH·的清除能力弱于Vc，而明显强于n-BO、WO.

表1 木蝴蝶不同极性组分对自由基的IC50值Table 1 IC50 value of different polar fractions of ofOroxylum indicumVent. to free radical

3.4 不同极性组分中活性成分含量

芦丁质量浓度在0～38.88ug·mL-1，以芦丁标准品溶液质量浓度X(ug·mL-1)为横坐标，510 nm处吸光度值Y为纵坐标绘制芦丁标准曲线，所得线性回归方程为Y=0.009 1X-0.005 2(R=0.999 3).没食子酸质量浓度在0～11.456ug·mL-1，以没食子酸标准品质量浓度C(ug·mL-1)为横坐标，765 nm处吸光度值A为纵坐标绘制标准曲线，所得线性回归方程为A=0.048 9C-0.004 7(R=0.999 6).

表2 不同极性组分的活性成分含量Table 2 Active ingredient contents of different polarities (x±s, n=3)

注：表中数据为3次重复平均值±标准差(x为平均值；s为标准差；n为重复次数).

分别按“2.3.1”和“2.3.2”法测定木蝴蝶醇提物中EAO、n-BO和WO的吸光度值，通过线性回归方程计算各极性中多酚和黄酮含量，结果见表2.

由表2 中的数据可见，EAO中多酚和黄酮的含量均高于n-BO及WO.黄酮、多酚两种活性成分总含量在EAO中最高，依次是n-BO、WO.两种活性成分在各组分中的含量有较大差异，且每一种活性成分在各组分中的比例也不一致.可见木蝴蝶醇提物经乙酸乙酯、正丁醇和去离子水分步萃取后，多酚和黄酮主要分布在乙酸乙酯相中.

3.5 活性成分含量与抗氧化活性相关分析

表3 活性成分含量与抗氧化活性相关性Table 3 Correlation between content of active ingredients and antioxidant activity

4 结论与讨论

目前认为植物中具有抗氧化活性的化合物主要是黄酮类化合物、酚类化合物、多糖类化合物等.其中，黄酮和多酚结构中具有的还原性羟基，能有效清除自由基，从而抑制氧化进程.通过木蝴蝶醇提物体外抗氧活性研究发现，相对于n-BO和WO，EAO清除自由基的效果最好，抗氧化活性最强，这与其黄酮、多酚含量相对较高密切相关，可以进一步提取、分离其功能性成分，测定其化学结构，研究其理化性质与生理药理作用，为木蝴蝶作为天然抗氧化剂的开发应用奠定基础.

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