HPLC法测定木蝴蝶中木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的质量分数

张昌壮, 张培旭, 姚 华, 杨 洁, 金永日, 李绪文, 李清民

(1. 吉林大学 化学学院, 长春 130012； 2. 吉林省烟草产品质量监督检验站, 长春 130062；3. 吉林大学 药学院, 长春 130021)

木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶(Oroxylumindicum(L.)Vent)的成熟种子, 具有止咳、 抗炎、 抗菌和抗氧化等作用, 其主要化学成分为黄酮及其苷类, 并含有对羟基苯乙醇和环己醇类化合物以及挥发油类化合物等[1]. 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B为木蝴蝶中的主要成分[2], 2010版《中国药典》增加了使用薄层色谱法的鉴别项, 对照品为木蝴蝶苷B和黄芩苷[3]. 文献[4]定量分析了木蝴蝶中非特征性成分黄芩苷; 文献[5]采用高效液相色谱法(HPLC)测定了木蝴蝶中黄芩素和白杨黄素的质量分数； 文献[6]采用HPLC法测定了木蝴蝶苷B的质量分数; 文献[7]采用HPLC法测定了木蝴蝶提取物中木蝴蝶苷A的质量分数; 文献[8]采用HPLC法, 通过梯度洗脱同时测定了木蝴蝶中13种化合物的质量分数. 本文使用一种简便的HPLC方法, 测定木蝴蝶中木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的质量分数.

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

木蝴蝶购自安徽亳州和河北安国等地, 经长春中医药大学邓明鲁教授鉴定为Oroxylumindicum(L.)Vent.的干燥种子； 实验用水为二次蒸馏水; 甲醇为色谱纯; 磷酸为分析纯； 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B单体均从木蝴蝶中提取分离得到, 其结构经核磁共振光谱鉴定, 经HPLC归一化法测得其质量分数分别为100.0%和99.12%.

1.2 主要仪器

Agilent1200型系列高效液相色谱仪配紫外检测器(美国Agilent公司); Mettlertoledo AG135型电子天平(德国Startorius公司); 加热回流装置和RE-201C型旋转蒸发仪(巩义市英峪予华仪器厂); KQ-250B超声波发生器(昆山市超声波仪器有限公司).

1.3 对照品溶液的制备

精密称取适量对照品木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B, 加甲醇制成每1 mL含木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B各0.1 mg的混合溶液.

1.4 供试品溶液的制备

称取0.200 g药材粉末(过100目筛), 用15 mL体积分数为85%的甲醇回流提取2次, 回流时间分别为1 h和0.5 h, 合并提取液并蒸干, 加甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中, 摇匀, 取上清液, 过0.2 μm微孔滤膜, 取续滤液.

1.5 色谱条件与系统适应性实验

色谱柱为COSMOSIL-C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm, 5 μm)； 柱温25.0 ℃； 流动相V(甲醇)∶V(φ(磷酸)=0.2%)=4∶6； 流速为1.0 mL/min； 波长为278 nm； 进样量20 μL. 将对照品溶液和供试品溶液各20 μL置于高效液相色谱仪分析测定, 其色谱图如图1所示. 在本实验条件下, 化合物木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的理论塔板数分别为3 800和6 500, 分离度分别为2.91和6.43.

图1 化合物木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的标准溶液(A)和样品(B)的HPLC色谱Fig.1 HPLC charomatograms of Oroxin A and Oroxin B of reference substances (A) and sample (B)

2 实验与结果

2.1 线性关系考察

精密称取适量木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B, 加甲醇配制成质量浓度均为0.100 mg/mL的混标溶液. 将该标准溶液稀释, 制得质量浓度分别为50.0,25.0,10.0,5.00,2.50 μg/mL的混标溶液. 分别取上述标准液各20 μL, 注入液相色谱仪, 考察峰面积对进样量的线性范围. 若以进样量X(μg)为横坐标, 峰面积积分值Y为纵坐标绘制标准曲线, 则木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的回归方程分别为Y=2 978.8X-21.931(r2=0.999 9)和Y=2 371.9X-10.88(r2=0.999 9), 两者线性范围均为0.050～2.0 μg.

2.2 精密度实验

量取质量浓度均为10.0 μg/mL的木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的混合溶液20 μL, 连续进样6次, 测得峰面积, 记录保留时间, 计算相对标准偏差(RSD), 考察日内精密度. 结果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B峰面积的RSD分别为1.47%和0.76%, 保留时间的RSD分别为0.10%和0.09%； 将该溶液连续6 d, 每天进样一针, 测得峰面积, 记录保留时间, 计算RSD, 考察日间精密度. 结果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B峰面积的RSD分别为0.85%和0.98%, 保留时间的RSD分别为0.33%和0.28%.

2.3 稳定性实验

取1号样品粉末, 按1.4方法制备供试品溶液, 分别于0,2,4,8,16,24 h按上述色谱条件进样分析. 结果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B峰面积的RSD分别为0.43%和0.28%, 保留时间的RSD分别为0.48%和0.34%. 因此, 供试品溶液在24 h内测定结果稳定性较好.

2.4 重复性实验

取1号样品粉末6份, 按1.4方法制备供试品溶液, 按上述色谱条件进样测定. 结果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的平均质量分数(n=6)分别为4.17%和3.57%, RSD分别为0.42%和0.76%.

2.5 加样回收率实验

分别称取6份已知质量分数的1号粉末样品、 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B对照品各100.0,4.10,3.60 mg, 按1.4方法制备供试品溶液, 按色谱条件进样测定, 计算回收率. 结果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的平均回收率(n=6)分别为101.14%和100.41%, RSD分别为1.07%和2.26%.

2.6 检测限与定量限

称取木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B各10.0 mg, 置于100 mL容量瓶中, 加甲醇溶解并定容, 稀释,得到两种对照品质量浓度均为1.00 μg/mL的标准溶液, 并用色谱仪记录其峰高, 计算信噪比. 测得木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的定量限为5 ng, 检测限为2 ng.

2.7 样品测定

将12个批次的木蝴蝶样品制成供试品溶液进行测定, 计算样品中木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的质量分数, 其中: 1～3号样品购于安徽亳州; 4～6号样品购于河北安国; 7和8号样品购于广东广州; 9号样品购于广东江门; 10和11号样品购于广西龙州; 12号样品购于贵州安顺. 样品测定结果列于表1.

表1 12种木蝴蝶样品中木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的质量分数

3 讨 论

3.1 色谱条件选择

本文考察了COSMOSIL-C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm, 5 μm)和Agilent ZORBAX-SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)两种色谱柱, 结果表明: 后者在选定的各种流动相条件下木蝴蝶苷A的分离度均小于1.5, 前者可有效分离木蝴蝶苷A; 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B在波长215,278,314 nm处均有较强吸, 在278 nm处吸收最强, 且节省紫外灯能量, 因此选定278 nm作为检测波长. 将V(甲醇)∶V(φ(冰醋酸)=1%)=38∶62,V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(φ(冰醋酸)=1%)=20∶20∶60,V(甲醇)∶V(φ(磷酸)=0.2%)=42∶58作为流动相的分析效果, 结果表明,V(甲醇)∶V(φ(磷酸)=0.2%)=42∶58 作为流动相可达到基线分离, 且分析时间较短.

3.2 对照品溶液与供试品溶液制备

实验结果表明: 木蝴蝶苷B在水中溶解度大, 但其水溶液不稳定, 放置一段时间后色谱峰分裂为2个; 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B均溶解于甲醇, 且其溶液稳定, 因此选择甲醇作为配制对照品溶液的溶剂. 在供试品溶液制备过程中, 考察了超声、 冷浸和加热回流等方法, 比较了乙酸乙酯、 乙醇、 体积分数分别为85%,70%,55%的甲醇的提取效果, 并考察了回流提取次数. 结果表明: 加热回流的提取方法效果最佳； 体积分数为85%的甲醇提取量最高, 15 mL溶剂回流提取2次即可将木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B完全提取.

3.3 质量分数测定结果

在不同产地的12个批次木蝴蝶样品中, 由于木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的质量分数均大于3.00%, 因此均可作为木蝴蝶质量标准的重要质量分数测定指标.

综上所述, 本文方法可同时测定木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的质量分数, 方法简便, 结果可靠, 可作为木蝴蝶质量控制的参考依据.

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