火炭母中黄酮提取工艺的优选

伍世恒，金晶

1.广东省中医院药学部，广东 广州 510120；2.中山大学药学院，广东 广州 510006

火炭母中黄酮提取工艺的优选

伍世恒1，金晶2

1.广东省中医院药学部，广东 广州 510120；2.中山大学药学院，广东 广州 510006

目的：优选火炭母中黄酮的提取工艺。方法：以槲皮素、槲皮苷和总黄酮的得率为指标，采用正交试验法考察乙醇百分数、料液比、提取时间和提取次数4个影响因素，优选火炭母中黄酮的超声提取工艺。结果：超声提取液中黄酮含量高于回流提取液，其最佳的提取条件为乙醇体积分数85%，料液比1∶15，提取时间为30 min，提取次数3次。结论：该工艺简单可行，成本低廉，安全可靠，为火炭母中黄酮成分工业化生产提供了理论依据。

火炭母；槲皮素；槲皮苷；总黄酮；超声提取法；正交设计

火炭母为蓼科植物火炭母(Polygonum chinense L.)或粗毛火炭母(Polygonum chinense L.var.hispidum Hook.f)的干燥全草[1]。在广东地区应用广泛，具有清热利湿、凉血解毒、平肝明目、活血舒筋等功效，为岭南习用中药。现代药理研究表明，火炭母具有抗炎，抗病毒、减压及抑制中枢神经的作用，治疗肠炎有较好的疗效[2]。火炭母主要化学成分为黄酮类、鞣质类、甾醇类，其中黄酮类是其主要有效成分，主要包括槲皮素及其苷类化合物[1]。火炭母的资源丰富，生长周期短，产量较大，开发为成药或保健品具有一定的经济价值，而目前尚无火炭母的提取工艺的文献报道。超声波提取技术是利用超声波所产生的强烈机械振动及空化效应等作用，从而达到缩短提取时间，提高提取效率的目的。与传统方法相比，超声提取法溶剂用量较少，提取时间较短，并且有效物质不被破坏[3]。本实验采用正交试验对其主要的影响因素进行考察，多指标评价火炭母中黄酮的超声提取工艺，为其工业化生产提供一定的参考依据。

1 仪器与材料

1．1 仪器 Agilent-1100高效液相色谱仪(DAD检测器、自动进样器、在线脱气、四元泵)(美国安捷伦科技有限公司)、KQ-300VDB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)、BS210S型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1．2 材料 槲皮素(批号：111893-200905)、槲皮苷(批号：110139-200903)、芦丁(批号：100080-200906)等对照品均购于中国药品生物制品检定所，火炭母(批号：201206232)药材由康美药业股份有限公司提供，经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定为蓼科植物火炭母Polygonum chinense L.的干燥全草；乙腈、甲醇(美国Burdick﹠Jackson公司)为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯净水。

2 方法与结果

2.1 提取工艺的设计 超声提取工艺：实验采用正交试验对火炭母中黄酮提取工艺中4个因素：乙醇百分数、料液比、提取时间、提取次数进行考察，每个因素选择3个水平。称取干燥火炭母药材粉末(过3号筛)10 g，加入到500 mL具塞的锥形瓶中，按照L9(34)正交表(表1)的试验顺序进行操作，超声处理的功率为250 W，频率为40 kHz，提取温度为35℃。采用综合加权评分法，以槲皮素、槲皮苷和总黄酮的含量作为评价指标，各指标进行“隶属度”的计算，其指标隶属度= (测定值－最小测定值)／(最大测定值－最小测定值)，0≤指标隶属度≤1。其具体的权重为：总黄酮得率占50%，槲皮素得率占25%，槲皮苷得率占25%。综合评分=总黄酮得率隶属度×50%＋槲皮苷得率隶属度×25%＋槲皮素得率隶属度× 25%，满分为1.00。回流提取工艺：精密称定火炭母药材粉末(过3号筛)10 g，置于500 mL回流装置中，加入95%乙醇200 mL水浴回流2 h，滤过，滤渣再加入95%乙醇100 mL加热回流1 h，滤过，合并2次滤液，95%乙醇定容至500 mL，摇匀，即得供试品溶液。

表1 L9(34)正交表

2.2 含量测定

2.2.1 总黄酮的含量测定[4]

2.2.1.1 供试品溶液的制备 按照2.1项方法进行提取，得到提取液，滤过，用少量95%乙醇洗涤滤渣，合并滤液，95%乙醇定容至500 mL，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.1.2 标准曲线的测定 精密称定芦丁对照品5.44 mg，置25 mL量瓶中，加95%乙醇至刻度，摇匀，即得0.2176 mg/mL的对照品溶液。取对照品溶液0、1、2、4、6、8 mL分别置25 mL容量瓶中，加95%乙醇至8 mL，再加入1 mL亚硝酸钠溶液(50 g/L)，摇匀，放置5 min，加入1 mL硝酸铝溶液(100 g/L)，摇匀，放置6 min，加入10 mL氢氧化钠溶液(40 g/L)用蒸馏水定容至刻度，摇匀，放置15 min显色，以0管为空白，在500 nm波长处测定吸光度，以吸光度A为纵坐标、浓度C(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线。得标准曲线方程为：A=13.65C－0.0045(r=0.999 9)，对照品溶液在0.008704～0.069632 mg/mL范围内线性关系良好。

2.2.1.3 精密度的考察 精密移取芦丁对照品1 mL，平行操作5次，按照2.2.1.2项下自“置25 mL容量瓶中”起进行操作，测定其吸光度A，计算器RSD%(n=5)值。结果RSD%= 0.12%。

2.2.1.4 含量测定 按照2.2.1.1项供试品制备方法进行提取，每份精密吸取2.0 mL，按照标准曲线下步骤进行操作，测定其吸收度，计算含量，结果见表2。

2.2.2 槲皮素与槲皮苷含量测定[5]

2.2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Extend C18(250 mm × 4.6 mm 5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液(38︰10︰52)；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；检测波长：254 nm；进样量为10 μL。

2.2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取槲皮苷和槲皮素对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得0.045 mg/mL槲皮苷和0.032 mg/mL槲皮苷的对照品混合溶液，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2.3 供试品溶液制备 按照2.1项方法进行提取，得到提取液，滤过，用少量95%乙醇洗涤滤渣，合并滤液，95%乙醇定容至500 mL，摇匀，精密移取该溶液10 mL，水浴挥干，残渣用甲醇溶解并定容至5 mL，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.2.2.4 标准曲线的制备 分别精密吸取混合对照品溶液1、5、10、15、20 μL，按照2.2.2.1项下色谱条件，测定槲皮苷和槲皮素的峰面积，以峰面积Y为纵坐标，进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线，得到槲皮苷和槲皮素回归方程分别为：Y=2710.17X-4.2126(R2=0.9996)和Y=3981.36X-1.4632(R2= 0.9997)；线性范围分别为：0.045～0.9 μg和0.032～0.64 μg。2.2.2.5 含量测定 按照上述2.2.2项下的含量测定方法，测定火炭母不同提取液样品中槲皮苷和槲皮素的含量。结果见表2、图1。

结果表明，影响火炭母中黄酮提取工艺程度依次为：D(提取次数)＞C(提取时间)＞B(料液比)＞A(乙醇百分数)，方差分析结果表明，D因素对火炭母提取工艺有明显的影响(P＜0.05)，因素A、B、C均没有明显的差异，为了节省溶剂，经综合考虑，得出最佳的提取工艺为：A2B2C3D3：即乙醇体积分数85%，料液比1︰15，提取时间为30 min，提取3次。

2.3 工艺验证与比较 见表3。采用上述含量测定方法测定火炭母最佳提取液和回流提取液中3种成分含量。表3结果表明，超声提取液中总黄酮、槲皮苷和槲皮素等3种成分含量均高于回流提取液，说明该工艺具有一定科学性，验证结果也表明，该工艺具有一定的稳定性。

表2 火炭母提取工艺的正交设计实验结果

图1 火炭母提取工艺含量测定HPLC图

表3 火炭母最佳提取工艺验证与比较的结果

3 讨论

文献报道表明，总黄酮、槲皮素和槲皮苷常作为其质量控制的指标。目前，同时测定火炭母中槲皮素和槲皮苷的高效液相含量测定方法尚未见报道，本实验对色谱柱、流动相、检测波长、流速等色谱条件进行考察与优化，建立了火炭母槲皮苷和槲皮素高效液相含量测方法，为其质量标准的建立与提高提供一定方法学依据。

研究表明，温度对超声提取工艺具有一定的影响，合适的提取温度能提高黄酮类成分的溶解率，但不宜过高，避免提取溶剂挥发。实验对提取温度进行了单因素考察，比较25℃、30℃、35℃、40℃等4个温度的黄酮提取率，结果表明，随着温度提高，黄酮类成分的提取率逐渐升高，35℃与40℃提取率差别不大，因此选择35℃进行超声提取。实验优选出火炭母的黄酮超声提取工艺，该工艺中总黄酮、槲皮素和槲皮苷等3种成分的提取率均高于回流提取工艺，且工艺操作简单、省时、成本低廉，稳定性好，应用于工业化生产将产生一定的经济效益，为该药材综合利用开发提供理论依据。

［参考文献］

[1] 朱华，高雅，张可锋，等．不同产地火炭母中槲皮素的含量测定方法研究[J]．中药新药与临床药理，2009，20 (6)：557-559．

[2] 王金香．火炭母药材HPLC指纹图谱研究[J]．中国实验方剂学杂志，2011，17(15)：96-98．

[3] 周伟，邵荣，吴俊，等．蒲公英黄酮的超声辅助提取工艺研究[J]．安徽农业科学，2012，40(5)：2696-2698．

[4]韦玉，高雅，张可锋．不同产地火炭母总黄酮含量测定[J].安徽农业科学，2011，39(6)：3265-3266．

[5]吴怀恩，甄汉深，韦志英，等．侧柏叶不同炮制品中槲皮苷与槲皮素的含量测定[J]．时珍国医国药，2009，20 (2)：354-356．

（责任编辑：马力）

R284.2

A

0256-7415（2016）06-0276-03

10.13457/j.cnki.jncm.2016.06.121

2015-12-05

伍世恒（1980-），男，主管药师，研究方向：医院药学与药物制剂。

金晶，E-mail：ilpf99@163.com。