猪链球菌研究进展

王 聪，刘翊中

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

猪链球菌研究进展

王 聪，刘翊中*

(西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一种重要的人畜共患病病原体，临床表现主要有脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症等病症.猪链球菌病的暴发不仅给养殖业带来巨大经济损失，而且还严重威胁到公共安全与健康.文章就病原的基本特征作简要概述，进而探讨目前已被广泛研究的和新发现的诸多毒力因子以及猪链球菌的致病机理，对目前应用较多的检测猪链球菌的方法进行综述，以期为猪链球菌的防控提供更多的理论依据，并为新型疫苗研发提供新思路.

猪链球菌；毒力因子；致病机理

猪链球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一种重要的人畜共患病病原体，可引起多种疾病，包括脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎等.1968年，丹麦首次报道了人感染猪链球菌的病例[1].此后，在欧洲、亚洲国家以及北美、南美、澳大利亚和新西兰都出现了相关的报道.迄今为止，中国已有多个省市报道了猪链球菌感染病例.据报道， 1998年[2]感染25人中14人死亡，近8万头猪受感染，2005年[3]感染215人中38人死亡，超过600头猪受感染.这两次重大猪链球菌感染事件主要是由于感染后引发了发病率和死亡率极高的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock-like syndrome, STSS)[4].近年来，猪链球菌病已经引起了世界范围的广泛关注，不仅仅是因为它给养猪业带来的巨大经济损失，更重要的是它已经严重威胁到公众健康.本文对猪链球菌病原特征、毒力因子及其致病机理、检测方法等展开相关综述.

1 病原的基本特征

猪链球菌在自然界中广泛存在，属球菌科、链球菌属，是一种革兰氏阳性细菌，有荚膜，无芽孢，多数呈短链或球状排列.需氧或兼性厌氧，因其对营养成分要求高，培养基中常需加入血液、血清等营养物质[5].致病力不同的菌株在血液琼脂平板上培养后可出现不同类型的溶血环(α型和β型).根据荚膜抗原分类的不同可将猪链球菌分为35个血清型(1-34型和1/2型)，其中1/2型、1型、2型、7型、9型和14型均可感染人，而2型致病性最强.

2 毒力因子

近年来，除了一些已经确定功能的毒力因子外，大量的研究发现猪链球菌还存在许多蛋白也与其毒力相关，但这些因子的致病机理还需进一步证实.根据其在细菌生命周期中的功能可分为表面/分泌因子、酶/蛋白酶、转录因子/调节因子以及其他一些因子[1].

2.1 表面/分泌因子

荚膜多糖(capsular polysaccharide, CPS)由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸五个单糖组成，研究发现其与猪链球菌的抗吞噬功能相关.溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein, MRP)作为猪链球菌的一种黏附素，帮助其在上皮细胞选择性增殖，胞外因子(extracellular protein factor, EF)是从细菌培养物上清中分离的一种蛋白，可根据MRP和EF的有无将猪链球菌2型分为MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-3种表型[6].溶血素(suilysin, SLY)能够促进猪链球菌对上皮细胞的黏附和入侵作用.纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein, FBP)是一种无锚结构的黏附素，与猪链球菌的定植能力有关，存在于各个血清型中(除32型及34型)[4].38 kDa蛋白是一种位于细菌表面或细胞壁上的蛋白.大量的研究已经表明，MRP、EF、38 kDa和SLY都可以作为良好的保护性抗原用于新型疫苗的开发[1].

除了上述6种已经确定的毒力因子，近年来，一些新的毒力因子及其功能逐渐被揭示.枯草芽孢杆菌样丝氨酸蛋白酶(Subtilisin-like serine protease A, SspA)是一种在C-末端含有LPXTG基序的细胞表面锚定蛋白.研究发现,猪链球菌SspA可以调节巨噬细胞分泌细胞因子，从而引发中枢神经系统的炎症反应及脑膜炎[7].HP0197也是一种细胞表面蛋白，等位基因缺失的突变株对小鼠和猪不致病，在感染过程中，由于荚膜变薄而且对吞噬细胞的抵抗减弱，猪链球菌容易被清除[8～9].此外， htps、hp272/sat、ofs、sao等存在与猪链球菌表面或是其分泌的蛋白也已证实与毒力有关，而且有些已作为保护性抗原被应用.

2.2 酶/蛋白酶

目前，已有20多种酶经研究证实能够影响猪链球菌的毒力.这些酶有的参与代谢和细菌表面结构的合成，有些则与免疫反应活性以及自身诱导剂的合成相关.甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)与猪链球菌的黏附能力有关，通常存在与胞浆中，GAPDH缺失株减弱猪链球菌对宿主的黏附[10].谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)作为一个重要的毒力因子，已经被广泛地应用到猪链球菌的分型与检测中.PgdA是一种猪链球菌肽聚糖葡萄糖脱乙酰酶，Fittipaldi等[11]发现pgdA缺失株感染小鼠和猪后毒性均减弱，而且pgdA缺失株很容易被中性粒细胞吞噬，与磷壁酸D-丙氨酰化酶(DltA)的毒力作用相似.

2.3 转录因子/调节因子

研究发现，已有近16种转录因子或调节因子参与猪链球菌毒力的调控.AdcR是猪链球菌控制锌转运的调节因子，Aranda等[12]发现该因子在小鼠模型中可抑制猪链球菌毒力.Willenborg等[13]发现分解代谢控制蛋白(catabolite control protein A, CcpA)缺失株导致荚膜变薄，对中性粒细胞抗性减弱.猪链球菌89K毒力岛二元信号转导系统SalK/SalR的缺失会导致26基因的表达水平下调，而且SalK-R缺失的突变株毒力明显减弱[14]. Li J等[15]发现CiaRH二元调控系统缺失的猪链球菌对细胞的黏附能力减弱，更易被吞噬，而且感染小鼠后毒力明显减弱.

2.4 其他

最近，研究发现不同的启动子猪链球菌的毒力有影响，orf2在猪链球菌中普遍存在，其启动子的调控能力在强毒株中更强[16].Li P等[17]发现VirA基因只存在于强毒株中，而且构建的功能互补株接种家兔后可致死，因此推断其与猪链球菌毒力有关.有研究发现，FeoBA 编码的铁转运系统可能参与到猪链球菌的致病过程中.此外，ZhaoY等[18]发现了猪链球菌的一组毒力因子，属于89K毒力岛IV型分泌系统.因此，还存在更多与猪链球菌毒力相关的因子有待探索和研究.

3 致病机制

定植是细菌感染的第一步，猪链球菌黏附和入侵黏膜上皮细胞决定了其能否定植.猪链球菌对上皮细胞的黏附取决于多种因子，如烯醇化酶(Eno)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)等[19～20].大部分猪链球菌都可以通过细菌表面蛋白与细胞外基质(ECM)结合，如纤连蛋白、纤维蛋白溶酶原和胶原等[21].但研究发现，有荚膜的2型猪链球菌只能够黏附在上皮细胞而不能入侵[22]，这可能是由于CPS阻碍了其与ECM的结合.

猪链球菌侵入上皮细胞到达深部组织或血液中，从而引发疾病.研究表明，CPS能够帮助猪链球菌躲避中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬与杀伤作用[23].CPS的这种抗吞噬作用依赖于其唾液酸(SA)成分，能够使其黏附在巨噬细胞上，从而减弱吞噬作用[24].在传播过程中，猪链球菌的生长代谢与微量元素的摄入有关，这需要微量元素的吸收调控蛋白、转运蛋白和结合脂蛋白等共同实现.

微生物感染过程中，免疫系统过度或不适当的免疫应答可能导致严重的炎症反应和感染性休克.研究发现猪链球菌感染后，毒力因子(如CPS、SLY等)诱导感染细胞释放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和IFN-γ等炎症细胞因子以及CCL2/MCP-1、CCL3、CCL5/RANTES、CXCL1/KC、CXCL8等趋化因子，从而激活NF-κB通路，引发炎症反应.这可能导致宿主在感染早期发生突发性死亡[21].

宿主若没有因败血症或中毒性休克死亡，猪链球菌将有可能突破血-脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)或血-脑脊液屏障(Blood-cerebropinal fluid, CSF)，侵入中枢神经系统(CNS)从而引发脑膜炎[21, 25].目前，引发脑膜炎的机制尚有争议，而且缺乏对其他病症机制的研究. “特洛伊木马”理论认为猪链球菌可以黏附在巨噬细胞表面或被其吞噬，突破血脑屏障后再将其释放[20].但也有研究表明，猪链球菌诱导脑微血管内皮细胞(BMEC)产生促炎症因子，增强细胞通透性，利于猪链球菌穿过屏障[26].最近，有一些研究发现,猪链球菌还可以通过其细胞壁成分SSU05-1000蛋白或SSU05-0272蛋白与BMEC相互作用，破坏BMEC细胞间的紧密连接，使猪链球菌从细胞间隙穿过血脑屏障[19].

4 检测方法

快速有效的检测方法对疾病的诊断和防控至关重要.目前，猪链球菌的检测方法主要有三种类型：微生物学方法、分子生物学检测和免疫学分析.

4.1 微生物学方法

猪链球菌在不同的培养基中生长特性不同，在固体培养基中培养时菌落小，呈圆形或卵圆形、边缘光滑整齐、单个或成双排列、颜色呈灰白透明且稍黏；在肉汤培养基中培养时管底呈絮状沉淀；而在血平板培养基上生长，菌落周围可出现溶血环.猪链球菌的生化反应可能因血清型不同或菌株不同而存在差异.能发酵葡萄糖和蔗糖，不发酵菊糖和马尿酸钠，对乳糖、蕈糖、甘露醇、山犁醇及水杨苷的发酵能力因毒株而异，不还原硝酸盐，接触酶阴性[27].

4.2 分子生物学检测

鉴于灵敏性和可靠性的优势，当前鉴定猪链球菌最常应用的是分子生物学检测方法.最为常用的是根据已知的猪链球菌特异性靶基因序列设计引物，从而鉴别猪链球菌不同血清型的多重PCR方法.Liu Z等[28]根据一种血清型特异的多糖聚合酶基因(wzy)建立了一种四重分型PCR，除了缺少此种特异基因的两对血清型外(1型和14型、2型和1/2型).此种方法可以鉴定出所有分离自猪的菌株血清型.此外，Nga 等[29]针对CPS2J 基因设计引物，建立了一种检测脑髓液(cerebrospinal fluid, CSF)中2型猪链球菌的实时荧光定量PCR方法(Real-time PCR)，此方法具有特异性强、灵敏度高的特点.Huy 等[30]根据常见的16S rRNA序列，应用环介导恒温扩增方法鉴别出包括猪链球菌在内的四种链球菌.Zhang J等[31]同样应用此种方法，根据靶基因CPS2J检测2型猪链球菌.由于LAMP不需要复杂的热循环且其结果可用肉眼观察，是一种快速检测技术，因此是临床和2型猪链球菌现场诊断的首选方法.除上述方法外，限制性片段长度多态性分析(RFLP)、随机扩增核酸片段多态性分析(RAPD)、脉冲场凝胶电泳法(PFGE)和多位点序列分析图谱(MLST)也是检测猪链球菌的有效方法.

4.3 免疫学分析

传统的免疫学检测方法包括协同凝集试验、平板凝集试验、荚膜反应试验、免疫印迹法、酶联免疫吸附试验(ELISA)、利用多克隆抗体的间接免疫荧光法和过氧化物酶-抗过氧化物酶法.其中，荚膜反应试验能分辨现有的35个血清型，协同凝集试验应用最为广泛[27].酶联免疫吸附试验是基于特异性捕获不同的猪链球菌抗原而建立的，是应用最广泛的免疫学方法.多克隆抗体的间接免疫荧光法和过氧化物酶-抗过氧化物酶法可用于组织切片中猪链球菌的检测以及在细胞内的定位等研究[32].近几年，一些新兴的方法已有报道.表面增强拉曼散射(SERS)是利用金纳米粒子(tAuNPs)作为底物检测2型猪链球菌的MRP抗体，Chen K等[33]应用此法检测猪血清中的MRP抗体以实现检测猪链球菌的目的，而且结果与ELISA检测相一致.Wang H等[34]首次应用电化学发光免疫传感器法检测2型猪链球菌，利用L型半胱氨酸与HPtPd双金属合金纳米粒子的结合形成纳米复合材料，模拟双酶的协同催化作用，导致大量氧气的生成、ECL信号增强，从而实现检测猪链球菌的目的.这种方法敏感性强、操作简单，可用于临床检测.Nakayama等[35]研究证实可通过免疫层析试纸条法检测尿液样品中的猪链球菌，利用胶体金与猪链球菌CPS的多克隆抗体结合，而且此方法能够对检测的抗原进行定量.

5 小结

猪链球菌作为一种危害性极大的人畜共患病的病原菌，可引发多种疾病甚至死亡，已经引起了国内外学者的广泛研究.尽管如此，其致病机理仍然存在一些有争议的问题，有待进一步阐明.由于猪链球菌血清型较多，毒力因子复杂不一.本文通过对猪链球菌的毒力因子做简要概述，并探讨了目前应用较多的检测方法，以期为检测方法的改进提供理论基础，从而建立一种最为快速准确的检测方法.同时，鉴于猪链球菌病的危害性较大，对毒力因子结构、致病性等的深入研究对疾病的防控具有重大意义，其中作为保护性抗原的毒力因子在高效安全的疫苗研制中可以发挥重要作用.

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Advance in Streptococcus Suis

WANG Cong, LIU Yi-zhong*

(College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China)

Streptococcus suis (S. suis) is a kind of zoonotic pathogen and can cause several diseases including meningitis, arthritis, endocarditis and sepsis. The outbreaks of streptococcus suis diseases not only bring massive economic losses to the pig industry, also threaten the publical safety and health. Firstly, the general characterization of streptococcus suis was summarized. Then, a wide range of both previously identified and recently emerging virulence factors were discussed in this paper. Additionally, the pathogenesis and various detection methods of streptococcus suis were also covered in this review. It hopes to provide more theoretical basis for the prevention and control of streptococcus suis and give a new insight to the development of novel vaccines.

Streptococcus suis; Virulence factor; Pathogenesis; Detection

2016-11-19

西北民族大学中央高校基本科研业务费专项资金资助研究生项目(Yxm2015209).

*

王聪(1994—)，女，黑龙江人，硕士研究生，主要从事病原生物学与动物疫病防治方面的研究.

S852.611

A

1009-2102(2016)04-0020- 05