肽聚糖水解酶——一种潜在抗葡萄球菌的武器

王英利，赵克强

（河北省沧州市动物疫病预防控制中心，河北 沧州 061000）

肽聚糖水解酶
——一种潜在抗葡萄球菌的武器

王英利，赵克强

（河北省沧州市动物疫病预防控制中心，河北 沧州 061000）

金黄色葡萄球菌是引起人类和动物食源性疾病的主要病因。由于耐抗生素葡萄球菌的出现，使得这一类疾病的治疗越发困难，迫切需要发展一些替代类药物。大量研究表明，肽聚糖水解酶（PHs）可控制和治疗这一菌属引起的感染。肽聚糖水解酶可快速的水解并引起金黄色葡萄糖球菌死亡。通常PHs对水解金黄色葡萄球菌的细胞壁成分具有较高的特异性，也能够裂解其他种类的葡萄球菌，对人类表皮葡萄球菌和其他的葡萄球菌同样具有杀灭作用。一些PHs可增强抗生素的杀菌和抑菌活性，因此，PHs无论是在酶学方面还是在抗生素方面都可被视为一种潜在的药物。一些研究表明，可以用异源性的表达系统来产生该酶类，如大肠杆菌表达系统。但我们更需要发展更有效的大规模生产此类酶的技术。

葡萄球菌；金黄色葡萄球菌；抗生素抗性；肽聚糖水解酶

葡萄球菌属于人和动物最重要的病原菌之一，它们可以引起广泛的疾病，如：皮肤和眼部感染、食物中毒、肺炎、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎。它的高致病性基于广泛的毒力因子如：蛋白A、凝固酶、胶原酶、透明质酸酶、溶血素、脂肪酶、不同的毒素、粘附蛋白以及一些影响生物膜形成的蛋白。另外金黄色葡萄球菌还发展出许多的机制来逃避感染的人类或动物体的保护性免疫应答。其中最重要和最有特征的是葡激酶、免疫球蛋白和金黄色葡萄球菌粘合因子。

由于耐药性的出现，金黄色葡萄球菌病的治疗显得尤其困难。1928年苏格兰生物学家弗雷明发现青霉素，并于20世纪40年代用于临床治疗。1942年发现了耐青霉素的葡萄球菌，先是在医院随后在医疗社区被发现，到20世纪60年代大约80%的在医院和社区分离出的金黄色葡萄球菌都是抗青霉素的。为了克服产生β内酰胺酶的金黄色葡萄球菌的感染，一些来自比彻姆医药公司的英国科学家发明了一个半合成的窄谱抗生素—甲氧西林。1960年杰文斯和他的同事们发现，从科林戴尔地区一家医院分离的5440株金黄色葡萄球菌菌株发现有3株是抗甲氧西林的。随后具有甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌菌株陆续从土耳其、印度以及波兰等多国分离到。从甲氧西林抗性葡萄球菌分离到葡萄球菌盒式染色体（SCC）MEC。SCCmec中最重要的部分是基因MecA，它是编码细胞壁合成的非敏感性β内酰胺酶，叫青霉素连接蛋白2a或2′（PBP 2a or PBP 2′），一个78-kDa的蛋白与β内酰胺类抗生素具有很低的亲缘性。甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌菌株（MRSA）通常被视作是具有多重抗药性的金黄色葡萄球菌菌株（MDR），这是由于许多耐药性基因重组到SCCmec序列上的结果，这也是关于基因移动元素的热点整合，如质粒、转座子、插入序列。

最初在医院发现的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌被称作医疗相关MRSA（HAMRSA）。20世纪90年在西澳大利亚的土著居民身上发现的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌被叫做医疗社区获得性耐甲氧西林葡萄球菌（CA-MRSA)。两者医疗相关性的克隆群不同，后者对绝大多数的抗生素敏感，但对β内酰胺类抗生素不敏感，呈现出一种潜在的毒力。1997年美国最先报道社区相关一名健康儿童死于MRSA感染的案例，表明这种社区获得性的耐甲氧西林葡萄球菌（CA-MRSA）的毒力更强。CA-MRSA对绝大多数的抗生素敏感。有数据表明MRSA感染已经占医院相关感染的50%，发病率和死亡率都比较高。在一些地区MRSA感染已超过50%，美国从1999-2005年MRSA感染病例增长到了62%，从294570增长到了477927人。而MRSA感染的人数增长了将近2倍，从127036人增长到了278203人。作者也提到2005年因葡萄球菌感染死亡的11400人当中大约有6640人死于MRSA感染。MRSA通常表现出MDR表型，其某些菌株出现了糖肽抗性和对糖肽的低敏感性。糖肽对治疗MRSA也变得不特效。目前发现了三类耐万古霉素的葡萄球菌：耐万古霉素葡萄球菌（VISA），异源性耐万古霉素葡萄球菌（hVISA）及高万古霉素耐性的葡萄球菌（VRSA）。目前从美国、伊朗和印度地区分离的耐万古霉素葡萄球菌仅有一些（Van A基因）表现出万古霉素完全抗性。VISA和hVISA对糖肽呈现低敏感性的潜在流行趋势。在VISA和hVISA首次报道于日本后，这两种菌株在世界各地陆续被发现。

葡萄球菌具有合成生物膜的功能，生物膜是一种细菌细胞产生的聚合体粘附于细菌细胞的表面对各种药物呈现惰性或是活性。生物膜可以延缓药物作用率和药物渗透，使微生物体对抗生素表现低敏感性。之前一些研究表明，在体外抗菌活性测定过程中，有生物膜的菌体比没有生物膜的菌体对抗生素的抗性高10～1000倍不等。

1 金黄色葡萄球菌细菌细胞壁成分

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球杆菌，直径约1μm，它的细胞包被有胞壁质球囊。其细胞壁由磷壁酸、表面蛋白，及大分子肽聚糖网络。肽聚糖由糖链组成，糖链是由交替的氨基糖N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸构成，五干肽成分是（L-Ala-D-iso-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Ala），它与乙酰胞壁酸的羧基端相连。每个肽干的赖氨酸部分与倒数第二个D-丙氨酸邻近的干肽相连，其中糖链与短的机动肽段相交联（Tomasz 2006）。细胞壁有压力容器的作用，可缓解内外压力，抑制酶活性。它还有参与肽聚糖合成的特性。肽聚糖结构中至少有五种化学键组，这些都是肽聚糖水解酶的靶位点。跨膜胎桥五甘氨酸是金黄色葡萄球菌细胞壁的唯一组成部分，是特殊的底物溶葡萄糖球菌酶，肽聚糖水解酶具有较强的杀菌作用，可成为一类可以替代抗生素类药物的武器，最近也被广泛的用于临床治疗，以及食品和兽医领域当中。为了防止水解酶对细菌菌体的水解作用，细菌菌体有自己特殊的调节机制-骨干肽。一些特殊的调节如N-乙酰化，糖基化，O-乙酰化。亦或是一些胎桥氨基酸序列的修饰给细菌带来了抗肽聚糖水解酶的能力。

2 抗葡萄球菌活性的水解酶

肽聚糖水解酶结构中有两个结构域：具有催化活性的N端结构域和C端的细胞壁结构域。噬菌体的PHs可称为裂解酶或内溶酶，又叫自溶素。它们在病毒感染的宿主菌体内具有重要作用。细菌的细胞壁是一个动态的结构，直接受细胞循环的调节。自溶素在细菌的生长中起重要作用，菌体的分化、细胞壁的流动、为遗传转化提供支持、形成鞭毛、产生孢子以及在β内酰胺类抗生素诱导下裂解细菌。

3 溶菌酶

病原性的葡萄球菌对各种溶菌酶都呈现出较高的抗性，如鸡蛋清溶菌酶。葡萄球菌的细胞壁可降低此类酶的敏感性，有部分研究表明，这主要是由C-6位置的O甲酰化以及N-乙酰胞酸残基形成的。Bera等人的研究表明，O乙酰基转肽酶在不同种类的葡萄球菌中的出现是导致溶菌酶抗性和致病性的原因。O乙酰胞壁酸只出现在具有致病性和溶菌酶抗性的葡萄球菌菌株中（如金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，路邓葡萄球菌，以及其他的葡萄球菌）。所有的非致病性的葡萄球菌都对溶菌酶敏感（如肉质葡萄球菌，沙门氏菌葡萄球菌，木糖葡萄球菌）。有报道称葡萄球菌对溶菌酶的抗性的机制有两种，第一：连接C-6位置的磷壁酸的甲酰化。第二：由于大面积的肽聚糖的侨联导致青霉素接合蛋白4活性的改变。

4 溶葡萄球菌酶

溶葡萄球菌酶是一种从模仿葡萄球菌体内分离的Zn2+金属蛋白酶。它能降解所有葡萄球菌菌属的细菌的细胞壁。其活性位点是葡萄球菌专有的五干肽跨膜桥。其他的革兰氏阴性和阳性菌对此溶菌酶不敏感。原始的溶葡萄球菌酶是由前蛋白体组成的包括33个氨基酸残基和一个由211个氨基酸组成的肽段前体以及一个由246个氨基酸组成的成熟蛋白。N端的肽（信号肽）连接于细胞内，被半胱氨酸蛋白酶移出细胞外的太短部分不参与降解葡萄球菌的细胞壁。已经成熟的具有催化活性的27kDa的溶葡萄球菌酶是前体蛋白溶菌活性的4.5倍，只有这种片段的酶在将来才有一定的应用作用。由模仿葡萄球菌产生的溶葡萄球菌酶不易自溶，因为它能够表达LIF蛋白（溶葡萄球菌酶免疫因子），这种蛋白是一种在穿膜桥梁3号和5号位具有丝氨酸残基的蛋白。组成蛋白主要是丝氨酸和丙氨酸而非甘氨酸，可以使得许多凝固酶阴性葡萄球菌降低对溶葡萄球菌酶的敏感性。因为葡萄球菌酶不水解甘氨酸-丝氨酸，丝氨酸-甘氨酸，丙氨酸-甘氨酸，甘氨酸-丙氨酸形成的肽键。此酶在pH为7.5温度为40℃的时候具有最佳活性，受外源性锌制剂的抑制如邻菲罗啉和EDTA。

具有五干肽跨膜桥的金黄色葡萄球菌对溶葡萄球菌酶非常敏感，可以此来区分葡萄球菌和其他菌属以及与葡萄球菌菌属极为近似的微球菌。

溶葡萄球菌酶于1964年被发现，在20世纪70年代已被成功的用于治疗又中性粒细胞减少引起的脓肿及由人类鼻腔内携带金黄色葡萄球菌引起的感染。到20世纪90年代，有大量的报道表明溶葡萄球菌酶是一个可以治疗MRSA 和VISA引起感染的潜在药物。Climo等人通过临床分离的甲氧青霉素抗性的葡萄球菌引起的兔子动物模型罹患主动脉瓣心内膜炎分别使用万古霉素和不同的静脉给药抗葡萄球菌素。在增加糖肽浓度的情况下，可逐步产生菌株对万古霉素抗性的降低。最有效的给药方案是将抗葡萄球菌素每天给药3次，饲喂无菌蔬菜的兔子的治愈率是10/11。与此同时未给药的对照组的兔子体内菌体水平上升至8.5×103CFU/g。但由耐苯唑西林的表皮葡萄球菌引起的主动脉心内膜炎却需要用到萘夫西林和抗葡萄球菌酶联合疗法。这种联合疗法的效果强于这两种药物的单独使用。

圣路易斯安娜州立大学的卡拉汉实验组揭示，溶葡萄球菌酶能够有效的治疗由甲氧西林敏感性和耐甲氧西林葡萄球菌引起的角膜炎，以及由MRSA引起的眼内炎。甲氧西林抗性的葡萄球菌菌株301（MRSA301）或者是一个低毒力的甲氧西林敏感性菌株ISP546注入兔的角膜基质中。在感染后4～9h或10～15h每30min兔子眼睛可以被局部治愈。用早期的疗法（感染后4～9h给药），溶葡萄球菌酶可以杀灭角膜内感染的所有的MRSA 301菌株，而对照组的角膜菌体浓度达到6.52×103CFU。感染MRSA301的角膜用万古霉素进行治疗仍然保持角膜内菌体浓度2.3±0.85×103CFU。当治疗在（感染后10～15h）开始时用抗葡萄球菌酶治疗的的眼部具体残存要小于使用万古霉素治疗的眼睛（0.58±0.34 vs.

5.83±0.16×103CFU/眼角膜）。卡拉汉和他的同事们也检测了由凝固酶阴性葡萄球菌引起的眼内炎在用抗葡萄球菌酶对其的治疗效果，凝固酶阴性葡萄球菌对于抗葡萄球菌酶更具有抗性，有趣的是调查的结果是成功的。用溶葡萄球菌酶对13个菌株进行的体外试验表明，它可以显著的降低细菌数量，只有耐甲氧西林的表皮葡萄球菌株（MRSE），科氏葡萄球菌菌株表现的结果不是很令人满意。用溶葡萄球菌酶治疗的耐甲氧青霉素型葡萄球菌和甲氧西林敏感性表皮葡萄球菌可有效抑制菌落形成达6倍以上。对沃葡萄球菌只是两倍抑制，对其它种属的葡萄球菌可以达到4倍抑制。

最近Desbois和Coote（2011）揭示出了溶葡萄球菌素和其他种类的抗菌素联合具有协同效应。酶的杀菌活性可被食物防腐剂或自然界中一些物质增强。一些溶葡萄球菌素和其他制剂联合使用可将食品产业中的葡萄球菌彻底根除。另外其他细菌对溶葡萄球菌素的抗性，使此酶变得非常有用。

5 Las-A葡萄球菌溶血素

除溶葡萄球菌素外，Las-A葡萄球菌溶血素的抑菌活性也已被发现。Las-A是由一个3kDa的信号肽，一个22kDa的前蛋白和一个20kDa的催化结构域组成。信号肽嵌插穿过内膜，前蛋白结构域共价连接于一种非胞内蛋白，之后它便被铜绿假单胞菌所产生的胞外蛋白酶水解。Las-A被推测出对于铜绿假单胞菌的毒力具有很重要的作用。包括胞外域脱落的细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖的降解，以及syndecan-1和弹性蛋白在结缔组织中降解。与溶葡萄球菌素相似的是这种酶也可以切割金黄色葡萄球菌细胞壁内的五干肽桥梁。但是Las-A这种酶却更有耐受性，它能够在其五干肽桥梁上做部分氨基酸的修饰，使得此类酶也具有水解其他种类的葡萄球菌的功能包括：腐生葡萄球菌，表皮葡萄球菌，沃氏葡萄球菌。这种酶的详细的催化机制已经被Spencer等人解决，这是由于Las-A具有3个特殊的结构域结构。

实验证明Las-A杀灭葡萄球菌比β内酰胺类抗生素和万古霉素更有效，但应用此酶抗葡萄球菌感染方面还有待于进一步的研究。Las-A比溶葡萄球菌素有更广泛的抗菌谱，它能治疗由表皮葡萄球菌引起的感染。目前为止，这种酶Las-A都是从绿脓杆菌培养基中分离出来的。在我们看来，生产此类酶的新方法和它在科研领域的应用将是近期需要研究的热点。

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2016．03.003