代谢组学技术在动物营养代谢病中的应用

曹　宇，孙玲伟，包　凯，王艳辉，夏　成，张洪友⋆

（1.黑龙江八一农垦大学，黑龙江　大庆　163319；2.江苏省肉羊产业工程技术研究中心，江苏　南京　210095；3.上海奶牛育种中心有限公司，上海　200436）

代谢组学技术在动物营养代谢病中的应用

曹宇1，孙玲伟2，包凯3，王艳辉1，夏成1，张洪友1⋆

（1.黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆163319；2.江苏省肉羊产业工程技术研究中心，江苏南京210095；3.上海奶牛育种中心有限公司，上海200436）

随着畜牧业的快速发展，我国对经济动物及其产品的需求日渐增加，高效畜禽品种的选育，动物营养代谢病的发病率日趋增加。作为系统生物学的重要组成部分，代谢组学可对机体代谢物的变化进行定量和定性的检测，为探索各种营养代谢病的发病过程及发病机理提供有力的技术平台。目前代谢组学在人类营养代谢病研究中已取得一定的成果，但在动物的营养代谢病上尚处于起步阶段。本文就代谢组学在动物营养代谢病中的应用进行综述，为今后的研究奠定理论依据。

动物营养代谢病；系统生物学；代谢组学；发病机理

1　前言

随着畜牧业的快速发展，畜禽营养代谢病在养殖业出现了高发状态，且因为其发病机理的复杂性以及治疗困难，逐渐受到研究者们的重视。目前，人们对动物营养代谢病的研究，主要在表观的症状和防控治疗方面。如何更加深入地了解营养代谢病的发生和发展机制，并应用于临床防治中，成为了畜牧业有待攻克的难题。

代谢组学技术的出现，将人们对病理表观的认识和代谢物分子动态变化联系在一起。代谢组学可从分子水平更系统全面地揭示疾病病理变化和发病机制，发现由疾病过程引起的代谢异常，以及各代谢性疾病之间的关联，为疾病的预防和治疗提供理论基础，还有助于疾病生物标志物的发现并辅助临床诊断与治疗的目的。代谢组学来源于代谢组[1]，是以组群指标分析为基础，以数据处理为手段，以信息建模整合为目标，通过对机体代谢产物在时间上的定量和定性分析，从总体上评价生命体的功能状况及其改变[2]。代谢组学所研究的是相对分子质量小于1 000的代谢物[3]，与其他组学相比，代谢物含量的微细变化与生物表型的大改变有直接相关性[4]。根据研究的对象和目的的不同，2001年Taylor等[5]将代谢组学分为4个层次：①代谢物靶标分析（metabol ite target analysis）：对某个或某几个特定的样品组分分析。②代谢轮廓（谱）分析（metabol ite prof i l ing analysis）：定量的对少数所预设的目标代谢产物进行分析。③代谢组学（metabonomics）：对限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量。④代谢指纹分析（metabol ite f ingerprinting analysis）：不分离鉴定具体单一组分，而是对样品进行快速分类。鉴于代谢组学技术上述特征，本文通过对近几年代谢组学在动物营养代谢病中的应用进行综合论述，为今后动物营养代谢病的研究提供理论依据。

2　分析技术平台

根据研究目的和研究对象的不同，代谢组学的技术程序和分析方法也各有不同，但一般都包括以下几个流程：样品的采集和预处理、样品的配制与检测、数据的处理和分析、代谢标志物识别和生化途径分析等[6]。目前，代谢组学中最为常用的是液相与质谱联用技术（LC-MS）、气相与质谱联用技术（GC-MS）和核磁共振技术（NMR）三种分析技术。通过这三种分析平台将代谢组学对小分子代谢物的分析分为目标分析和非目标分析[7]。

2.1核磁共振技术核磁共振主要是由原子核自旋运动引起，根据电子绕原子核运行所产生的屏蔽效应可作出NMR图谱。其中，1H NMR是目前疾病监测研究中的主流技术手段，人们通过目标质子与参照物质中相对应的质子之间共振频率的差异（百万分之一）来确定1H NMR的化学位移。

NMR分析技术具有多重优点：针对样品检测无偏向性，且预处理简单、对样品损伤性小，因此可较全面的对样品进行定性检测；但由于其灵敏度较低，因此不适合分析大量低浓度代谢物。

2.2气相色谱--质谱联用技术气相色谱-质谱联用技术是将色谱仪与质谱通过适当的接口相结合完整的分析仪器[8]。其原理是样品主份不同，各主份通过色谱柱进入质谱分析仪，样品被离子化经过电场或磁场的筛选，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果[9]。

气相色谱-质谱联用技术可提供较高的分辨率和检测灵敏度，并且有可供参考、比较的标准谱图库，可以方便地对相对质子质量小于800的热稳定、易挥发性含羟基、羧基、氨基和亚氨基等基团的极性强的化合物或处理后具可挥发性的样品定性结果[10]。但由于GC-MS只能对其中的挥发性组分实现直接分析，从而得不到体系中难挥发的大多数代谢组分的信息。而且样品准备工作比较繁琐，因此，常常作为其他的辅助检测技术。

2.3液相色谱--质谱联用技术液相色谱-质谱联用技术主要由液相色谱系统（LC）和质谱仪（MS）等部分组成。其基本原理是液相色谱对所检测物质进行分离，然后通过质谱来鉴定，具备LC的特性（如分辨率高、灵敏度高）和MS的特点（如测序速快、精确度高）。

液相色谱-质谱联用技术适用于那些热不稳定、不易挥发、极性更大、不易衍生化合分子量较大的物质。相对于其他组学，LC-MS具有较高的灵敏度和选择性；多种柱效结合分析（如C18，Amid，HILIC，T3，Phenyl），也使样品的分析范围广泛；善于定性定量分析。但LC-MS需要标准品以及独立的数据库，致使其分析能力受到了限制。

通过代谢组学分析技术平台对样品进行一系列处理后，需要对各种分析手段（NMR、LC-MS和GC-MS）各自的特点，进行相应的算法对原始谱图的数据进行提取、峰对齐[11]、去噪[12]等处理。然后需要对这些数据进行分析，挖掘隐含于其中的有用信息。数据分析包括无监督模式识别方法和有监督识别方法，无监督模式识别：该方法用于从原始谱图信息或与处理后的信息中对样本进行归类，并釆用相应的可视化技术直观地表达出来。该方法将得到的分类信息和原始信息进行比较，建立代谢产物与原始信息的联系，筛选与原始信息相关的一些标记物，进而考察其中的代谢途径。由于该方法没有可供学习的训练样本，成为无监督识别方法。主要有：主成分分析[13]、非线性映射[14]、族类分析[15]等，其中应用最广泛的为主成分分析。有监督识别方法：在已有知识的基础上建立信息组，利用己知的信息组对数据进行归类、识别和预测分析。由于建立模型时有可供学习利用的训练样本，故称有监督方法。最常用是主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）和 偏 小 二 乘 法（Par tialleast squares,PLS）。PCA在不作任何介入和无任何假设的前提下给出待分析样品的内在区别，而PLS则有一定的假设。对这些方法，尤其是指导性方法的选择都是有—定条件的，也正因为如此使用指导性分析方法时要格外注意假设的基础和成立性。

3　代谢组学在动物营养代谢病中的应用

3.1在单胃动物营养代谢病研究中的应用肝脏是糖、脂肪和氨基酸代谢的主要场所，在物质代谢和转运起到了举足轻重的作用，肝脏发生代谢紊乱及损伤常常导致营养代谢病的发生，而传统医学通过血液指标对肝脏及代谢过程的监测，往往不能及时反映机体代谢状态，而代谢组学通过对代谢物的检测，为疾病的诊断和挖掘代谢通路提供有力的技术支持。Saitoh W等[16]使用液相色谱技术对小鼠肝脏急性损伤进行分析，发现当小鼠肝脏受损时，精氨酸到鸟氨酸代谢途径会受到影响，并阐明血中精氨酸和鸟氨酸水平有可能成为肝脏急性损伤的潜在标志物。Matsuzaki K等[17]对过量摄入亮氨酸的大鼠血浆代谢组学分析表明，尿素和小-酮异已酸可能是氨基酸过量摄入时的标识物。Ber t ram H C等[18]利用基于NMR的代谢组学的方法来探索分别以黑麦或小麦为主的富含纤维的饲粮对高胆固醇血症猪内源性生化效应的影响，揭示了高胆固醇血症猪摄入高纤维黑麦饲粮后，血浆碱含量增加，并找出了评价血浆碱含量的标识物。李民等[19]进行了营养不良大鼠血浆小分子物质代谢组学的研究，结果表明营养不良组大鼠与正常大鼠相比，血浆中肉毒碱和色氨酸含量增加，而甜菜碱、棕榈酰肉碱、亚麻酸、二十二碳六烯酸和花生四烯酸等含量均降低，因此代谢组学可作为营养不良指标的筛选方法。Kowalski G M等[20]通过饲喂高脂肪日粮对小鼠骨骼肌动员葡萄糖代谢通路的气象色谱-质谱技术分析发现，骨骼肌动员葡萄糖衍生碳进入三羧酸循环进行氧化，是通过丙酮酸氢化酶派生的，而不是通过丙酮酸羧化酶介导的。Noguchi Y等[21]表明用代谢组学的方法可以定量测定氨基酸代谢物，可估计摄入适量的氨基酸与安全范围，可研究某种代谢产物与摄入过量的蛋白质、氨基酸的相关性，以此确定适量安全的氨基酸摄入量。

养殖场对日粮存放不当，会使饲料组成成分发生改变，而这对机体的伤害也会导致营养代谢病的高发。Solanky K S等[22]运用基于NMR的代谢组学研究发现，表儿茶素（EC）使SD鼠内源代谢物水平发生明显变化，EC进入体内影响内源性物质的代谢途径，代谢能力降低，碳水化合物代谢水平下降，还可能引起肝脏、肾脏功能改变等。Toue S等[23]通过基于NMR代谢组学技术研究蛋氨酸代谢的标识物，揭示了高半胱氨酸是监测蛋氨酸是否过量的良好指标。施寿荣[24]利用代谢组学和转录组学共同揭示了脂类物质代谢在腹水综合征肉鸡上发生了异常，二羟基丙酮可能是低温诱导腹水综合征肉鸡的潜在代谢标志物；甘油磷脂类物质氧化生产溶血甘油磷脂类物质是早期腹水综合征肉鸡发病的重要机制。两种组学研宄手段的结合为系统地阐释AS的代谢特征及其发生机制提供了更加全面的信息。谷类常常受到脱氧腐镰刀菌烯醇的污染，而猪对其特别敏感，常常导致猪发生氧化应激，肠上皮细胞的凋亡，同时会引起猪能量、脂肪和氨基酸代谢絮乱，而通过对小猪补充谷氨酸发现，谷氨酸可减少机体氧化应激，促进肠上皮细胞的增值，减少DON引起的代谢絮乱[25]。

另外，代谢组学也可应用于饲料添加剂对动物的效果研究。He Q等[26]采用基于NMR的代谢组学技术对饲粮中添加精氨酸对生长猪的影响进行了研究，发现增加饲粮中精氨酸添加量能改变机体脂肪和氨基酸的代谢过程，提高骨骼肌中蛋白质的合成，调节肠道微生物的代谢，显著提高猪的生长性能。Avery L B等[27]对患有脂肪肝的大鼠饲喂丙戊醇发现，丙戊醇是酰苷酸活化蛋白的新的活化剂，它可减轻肝脏中脂肪的沉积。

3.2在反刍动物营养代谢病研究中的应用反刍动物发生营养代谢病主要是由饲养管理不当引起。由于泌乳的需求，反刍动物机体常常处于能量负平衡状态，而如何掌控反刍动物对营养物质需求的量成为了当今世界性的难题。随着机体的病理变化，体液和组织中的代谢产物也产生了相应的变化。代谢组学对这些由疾病引起的代谢产物的相应进行分析，能够帮助更好地理解病变过程及机体内物质的代谢途径，还有助于疾病的生物标志物的发现和辅助临床诊断的目的。目前，已有大量的研究报道利用代谢组学技术来研究动物的各种代谢性疾病的发生过程和结果。Hai lemariam D等[28]通过液相色谱质谱分析技术对围产前期和围产后期奶牛进行了分析，发现肉毒碱、丙酰肉毒碱等三个化合物可能成为预防奶牛围产期疾病的生物标志物。孙玲伟[29]应用1H NMR与GC/ MS联用技术，获得了奶牛临床酮病和亚临床酮病的代谢差异物，而其中有些代谢差异物可作为奶牛酮病诊断的生物编织物；并全景式地揭示了发生酮病时，机体发生了广泛的代谢紊乱。Imhasly S等[30]通过液相色谱-质谱联用技术对脂肪肝奶牛代谢标志物进行了分析，发现29个差异代谢物。Bert ram H C等[31]使用丙二醇诱导奶牛中毒，使用NMR对奶牛血液和瘤胃液进行分析，发现丙二醇诱导中毒后，会导致奶牛呼吸困难血管收缩。肺部血管收缩，血中血红蛋白氧饱和度显著下降。Saleem F等[32]通过基于代谢组学技术对奶牛饲喂高谷物日粮引起奶牛代谢病的紊乱增加的机制进行了研究，表明泌乳早期饲喂高谷物日粮会使机体产生大量的炎性因子，同时引起氨基酸代谢紊乱。李影[33]应用代谢组学的1H NMR技术筛选和确证了Ⅰ型酮病和Ⅱ型酮病的血浆差异代谢物，不仅验证了奶牛酮病发生过程中糖、脂类和氨基酸的代谢紊乱，也为今后进一步探究Ⅱ型酮病的发病机制和防治奠定理论基础。

4　小结

目前，基于动物营养代谢病的代谢组学研究还有待于探究，但对于营养代谢病的发病机制和营养代谢病生物标志物的研究中发挥越来越重要作用。由于代谢组学分析技术造价昂贵，目前在国内动物营养代谢病领域中还没有普及，此外，以目前的检测技术对代谢物的全方位的检测和分析限制很大，且对后期庞大的数据高效分析也是目前研究者们厄待解决的问题。因此，基于动物营养代谢病的代谢组学中研究还有很大发展的空间。由此展望，随着各种代谢组学检测手段和数据统计技术的不断完善，以及代谢组学与各其他组学技术联用，将为动物营养代谢性疾病的发病过程和机理的系统研究提供技术支持。

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App lication ofmetabonom ics in animalnutritionmetabolic diseases

Cao Yu1，Sun Lingwei2，Bao Kai3，Wang Yanhui1，Xia Cheng1，Zhang Hongyou1*
(1.Col lge of Animal Science and Veterinary Medicine,Heilongj iang Bayi Agricul tural University,Hei longj ing
Daqing163319; 2 Jiangsu Engineering Technology Research Center of Mutton Sheep&Goat Industry,JiangsuNanj ing210095; 3 Shanghai dairycow breeding center Co.,Ltd.,Shanghai200436)

With the rapid development of the stock farming,increased demand for animals products,increasingly incidence of variable nutritional metabol ic disease.As a par t of system biology,organism metabol ites can be quantitative and qualitative detected by metabolites for exploring the process and the pathogenesis of various metabol ic diseases.Metabolomics had made certain achievements in the study of human disease,but sti l l in its infancy in animal metabol ic diseases.In this paper,the appl ication of metabolomics in animal nut rition metabol ic disease was reviewed,lay theoretical basis for the future research.

Animal nutrition metabol ic diseases;System biology;Metabolomics;Pathogenesis

S856

A

1672-9692(2016)01-0052-06

2015-11-08

曹宇（1991-），男，黑龙江省大庆人，在读研究生，研究方向为临床兽医学。

张洪友（1960-），男，教授，硕士研究生导师，研究方向为临床兽医学。

国家自然科学基金（31072181）和国家科技支撑计划课题（2012BAD12B03-2）。