乳腺癌干细胞调控机制的研究进展

蒋雪梅，顿耀艳综述，肖长义审校

（三峡大学医学院，湖北宜昌443002）

乳腺癌干细胞调控机制的研究进展

蒋雪梅，顿耀艳综述，肖长义审校

（三峡大学医学院，湖北宜昌443002）

乳腺肿瘤；干细胞；微RNAs；综述

白血病干细胞在1994年被Lapidot等［1］发现后癌症干细胞（CSCs）的概念已被接受［1］，CSCs启动肿瘤的形成。据报道CSCs存在于多种肿瘤中，包括乳腺癌、肺癌、白血病、胶质瘤、结肠癌、肝癌等；同时，一些分子标志已经被使用于分离整个癌细胞群，例如乙醛脱氢酶（ALDH）针对乳腺癌干细胞（BCSCs）、CD90和CD133针对肝癌干细胞、ABCB5和CD271+针对胶质瘤癌干细胞、CD133针对脑肿瘤干细胞。CSCs是异源的，例如BCSCs和结肠癌干细胞包括至少2种不同的分子标记类型鉴别CSCs［2］。从遗传学角度来说，BCR-ABL1淋巴细胞白血病包含多种明显的白血病干细胞亚克隆［3］。

目前，已经揭示一些信号途径在调节CSCs的自我更新和分化中起了关键作用。Wnt信号对CSCs自我更新是重要的，例如，整体存活更差的低分化的基底乳腺癌Wnt/β连环蛋白信号被激活［4］。Wnt信号的基本活化作用被肿瘤抑制剂APC的突变导致BCSCs的扩增。Her2+乳腺癌Wnt抑制信号抑制肿瘤的启动和转移［5-6］。Notch信号在调节CSCs是重要的，例如已有报道从肺腺癌和乳腺癌中Notch-GFP系统被用于分离CSCs，GFP+癌细胞能分化成GFP-癌细胞，并且有很强的肿瘤启动能力［7-8］。Notch信号诱导脱乙酰基酶（SIRT2）具有脱乙酰基和激活ALDH1A1及增加BCSCs的作用［9］。除这些信号途径外，表皮生长因子-β（TGF-β）、IL-6/JAK/STAT3、核因子-κB（NF-κB）信号和其他信号途径在调节CSCs上起关键作用，并且其在调节上有时互相干扰。

1　BCSCs

2003年Clarke等分离了假定的BCSCs作为ESA+CD44+CD24-细胞群。几乎很少的ESA+CD44+CD24细胞在体外能够产生肿瘤。另外，继发性肿瘤与原始肿瘤表型类似（形态学和ESA/CD44/CD24表达模式，肿瘤源性的ESA+CD44+CD24-肿瘤细胞至少能被连续在体外通过4条通道。有研究使用了几种方法适应干细胞的研究来分离或研究BCSCs，包括SP测定、Aldefluor测定和球形测定，SP测定是根据干细胞的能力排除DNA的测定。例如，通过膜转运者Hoechst 33342，SP测定已经显示在乳腺癌细胞株内包含最易生肿瘤的群并且在体外被移植。Aldefluor测定代表一组酶催化的氧化。在恶性乳腺上皮，在体内外具有高度ALDH的活性与最大的自我更新和分化能力有关。ALDH免疫染色阳性与乳腺癌有较差的预后相关性［9］。当生长在体外非黏附的类似球体BCSCs也被浓集。2个肿瘤启动群（ALDH+细胞和ESA+CD44+CD24-细胞）仅仅显示有限的重叠（Box1）。通过其他组乳腺癌包含肿瘤起始细胞显示不同细胞的表面标记也被显示相似的发现［10］。尽管BCSCs的异质性，这些细胞通常与治疗抵抗和肿瘤relapse相关，在癌症治疗中有2个主要障碍。因此，理解CSCs的生物学将帮助靶向CSCs的新治疗方法的发展，以利于更有效的治疗和癌症的最终治愈。

BCSCs被microRNAs（miRNAs）调控，miRNA通过mRNA调节靶向。miRNA的生物机制已经被Kim等［11］详细总结。有研究已显示，miRNAs在实体瘤和白血病中调节细胞增生、侵袭、转移和肿瘤的血管形成。miR-29通过靶向Mcl-1和Bcl-2促进肝细胞、癌细胞的凋亡［12］。在乳腺癌miR-10b通过靶向RHOC启动肿瘤的侵袭和转移。miRNA测定分析显示了let-7a在乳腺分化的癌细胞被下调。一些蛋白甲基转移酶不仅催化组蛋白的甲基化，还催化非组蛋白的蛋白质。例如，SET7/9催化组蛋白3的单甲基化，也催化K135的Lin28A的甲基化来促进Lin28在核内的聚集，并且增加稳定性和Lin28的prilet-7结合能力［13］。miR-200家族包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429肿瘤抑制剂。通过靶向ZEB1和ZEB2而抑制EMT。通过靶向BMI1 miR-200c抑制BCSCs。miR-200b通过靶向E-连环蛋白SUZ12、H3K27me3和其他基因而抑制BCSCs［14］。近年来，Pandolfi等发现miR-22通过靶向TET1、TET2及TET3促进EMT，肿瘤浸润和正常BCSCs的转移；miR-22的过度表达提高了一些多能性和EMT-相关基因的表达，例如BMI1、ZEB1及ZEB2。TET1、TET2及TET3能抑制miR-200启动子的脱甲基化。因此，miR-22通过抑制miR-200的表达促进BCSCs，表明DNA脱甲基酶能调节BCSCs。miR-93在来自于乳腺癌不同亚型的BCSCs起不同作用。在乳腺癌细胞基底型中，例如SUM159通过靶向AKT3、SOX4和STAT3，miR-93抑制CSCs和启动间充质-上皮的转化（MET）。然而，在窗型乳腺癌中如人乳腺癌细胞（MCF-7）能促进BCSCs，表明miR-93调节BCSCs的双重作用是依赖细胞分化的状态，但该机制还在被阐明［15］。除了BCSCs外，miRNAs的调节异常在其他类型的CSCs也被发现。在结肠癌干细胞里，miR-34a的功能主要依赖其表达水平；高miR-34a表达抑制Notch信号途径和促进CSCs的分化；低miR-34a的表达促进Notch信号途径和保持CSCs表型。越来越多的研究显示，miRNAs通过被链接到治疗载体，例如，纳米粒子能潜在地被用于治疗肿瘤。

2　lncRNAs在调节乳腺癌和CSCs的调节发挥重要作用

长非编码RNAs（lncRNAs）是长度大于200 nt的非编码RNA。大量lncRNAs已被发现，但只有少数lncRNAs现在已被充分研究。最近，lncRNAs已在许多癌症中被研究，例如，lncRNA-ATB在肝细胞癌、乳腺癌和结肠癌里通过TGF-β激活诱发EMT［16］。其不仅作为竞争内源性RNA（ceRNA）竞争性的结合miR-200家族上调其目标和诱发EMT，但是还结合IL-11 mRNA，增加IL-11的稳定性和诱导IL-11的自分泌来激活STAT3通路，这个通路在调节BCSCs发挥至关重要的作用。lncRNA-ATB可能通过调节miR-200家族和STAT3来调控BCSCs。

BCAR4可以诱导GLI目标基因的激活和促进乳腺癌的转移，特别是三阴性乳腺癌。GLI的靶基因在BCSCs发挥关键作用。这些表明BCAR4可调节BCSCs，并通过进一步的研究被证明。此外，lncRNA lncTCF7调控肝细胞癌干细胞自我更新证明了通过体外肿瘤球形形成能力和体内肿瘤启动频率。lncTCF7重新募集SWI/SNF复合体结合TCF7启动子和激活TCF7的表达，TCF7激活Wnt途径来扩充肝细胞癌干细胞［17］。lncRNA-ROR是一个细胞重新编程和多能性的调制器。对于乳腺癌，lncRNA-ROR诱导EMT和促进其转移，lncRNA-ROR过度表达会增加CD24-CD44+细胞群百分比和微球体数量。进一步的分析表明，其可以作为靶向EMT诱导者ZEB2和阻断ZEB2退化来促进EMT［18］。随着lncRNAs研究进展，越来越多的lncRNAs将在调节CSCs被得到证实。lncRNAs代表一种新型的CSCs调节器，其通过调节miRNAs、mRNAs和其他的lncRNAs。lncRNAs的研究将提高CSCs新型分子调节的理解，lncRNAs可以针对新的治疗方法和预后因素作为目标功能。

3　组蛋白调节器

组蛋白H2A、H2B、H3和H4被组蛋白修饰酶，包括组蛋白乙酰转移酶、组蛋白甲基转移酶和组蛋白去乙酰酶修改。通过调节染色质的状态在调节转录中发挥作用，其也彼此串道。H3K4脱甲基酶Jarid1B/KDM5B在乳腺癌被放大和过度表达来促进细胞增殖。RNA-seq和ChIP-seq分析揭示了Jarid1的结合位点是显著富集在启动子和增强基因腔型的比基底型的高，表明其是一个腔型联系的启动致癌基因［19］。共激活剂相关的精氨酸甲基转移酶1（CARM1）甲醇化物BAF155在R1064。BAF155甲基化在体内和体外促进乳腺癌的入侵和转移。染色质免疫沉淀反应（ChIP）分析表明，CARM1控制c-myc通路中的基因表达［20］。

3.1NYD1/KDM2BH3K36me1/2和H3K4me3脱甲基酶NYD1/KDM2B在ES和iPS中起一个重要作用。其被多能性因素OCT4和SOX直接调控，且与Ploycomb抑制性复合物1（PRC1）的核心单元相互作用，如Ring1B和征募PRC1到控制细胞分化的启动子基因的CpG岛，导致分化基因的抑制。这也表明KDM2B可以作为Polycomb组抑制元素（PRE）来抑制分化基因的表达［21］。KDM2B是一种致癌基因，不仅促进乳腺癌还维持BCSCs。KDM2B结合的部位编码miR-200家族，miR-101、miR-181及miR-203。SUZ12、EZH2、RING1B、BMI1是这些miRNA的直接目标，并且KDM2B通过抑制这些miRNA抑制BCSCs和上调PcG蛋白的核心亚单元［22］。

3.2EZH2和SUZ12EZH2和SUZ12属于PRC2。EZH2是组蛋白甲基转移酶并催化H3K27me3、SUZ12刺激EZH2的活性。EZH2在胚胎干细胞、成体干细胞和癌症中起关键作用。例如，在乳腺EZH2维持腔型祖细胞的自我更新［23］。EZH2也是一个致癌基因且在pRB-E2F通路的下游。EZH2可以作为癌症早期诊断的分子标记，并且EZH2在正常乳腺上皮细胞超表达增加了患癌症的风险。此外，EZH2在乳腺癌被上调，高水平的EZH2与侵袭性的乳腺癌相关。在临床样本中，EZH2的表达和Notch1呈正相关。EZH2降解抑制来自三阴性乳腺癌的异种移植的出现和增长，并且当EZH2过表达相反的表型也出现。EZH2过度表达激活Notch1信号活动来促进BCSCs的自我更新。进一步分析表明，EZH2调节Notch转录活动依赖直接结合Notch1启动子而非组蛋白甲基转移酶的活性。在恶性胶质瘤干细胞，EZH2激活STAT3信号，促进致肿瘤性［24］。Jung等［25］发现PAF（PCNA-相关因子）与β-连环蛋白相互作用来募集EZH2和形成转录复合物，该复合物特别反式激活Wnt信号的目标基因，暗示EZH2通过激活Wnt通路扩充BCSCs，这表明EZH2可能是中心蛋白质，并由几个关键的信号通路调节CSCs。进一步的研究还需要揭示调控机制。

SUZ12促进Hox基因的沉默、细胞增殖和胚胎发生。在一些癌症里SUZ12经常被发现突变，例如，SUZ12突变引起周围神经鞘瘤的恶性转换［26］。SUZ12也是一个直接目标miR-200b，其是BCSCs抑制剂。miR-200b部分通过SUZ12抑制BCSCs，但SUZ12调节BCSCs的分子机制还有待阐明。

3.3BMI1BMI1-PRC1是规范的组成部分，一个E3泛素连接酶和压缩的多聚核小体的辅助因子。越来越多的证据表明，BMI1在调节正常的和CSCs的自我更新方面起着重要作用。BMI1是肠道干细胞的标志，并且BMI1抑制剂已被发现抑制结直肠癌干细胞［27］。BMI1在BCSCs的自我更新中起着关键作用。Neven等［28］报道了lncRNA FAL1在某些类型的癌症，包括乳腺癌里过度表达，且其和BMI1-PRC1复合体相互作用，通过阻断其蛋白酶体的降解来增强其稳定性，且影响了H2AK119的泛素化水平表观遗传抑制基因的表达，例如，CDKN1A［28］。PRC1通过PREs结合目标位点，且PREs也许是ncRNAs或蛋白质，例如，Jarid2、KDM2B和HOTAIR［29］。这些表明BMI1能与ncRNAs互相干扰。

4　小结

ncRNA的作用和组蛋白调节器调节BCSCs。越来越多的非编码RNA已经被发现调节CSCs，并且组蛋白调节器的新功能和机制也变得越来越清晰。miRNAs是短序列ncRNAs，并且其容易与纳米向量共价结合。当miRNAs或特定的miRNAs反义核苷酸能被纳米向量传递给肿瘤细胞，肿瘤细胞将被nanovectors根除。所以，药物的纳米载体发展是很重要的。lncRNAs是CSCs新发现的监管者，并且调节机制通过调查越来越多的lncRNAs变得越来越清晰。lncRNAs也可以作为治疗目标起作用。例如，抑制lncRNA具有锁核酸的BCAR4（LNA），基于反义的寡核苷酸抑制乳腺癌的转移［30］。迄今为止，CSCs不能像胚胎干细胞一样在体外未分化的状态被培养，具有特定标记的流式细胞术是分离CSCs的主要方法。一些重要的技术用于研究机制，例如，ChIP和ChIP-seq需要一个更大的细胞数量，其不适合CSCs的研究。但是新技术单细胞RNA测序等和ChIP-seq 500细胞［31］，将为CSCs的研究带来新的希望。例如，表观遗传调节蛋白质在CSCs的调节中发挥重要作用，但监管调节机制仍未深入研究是由于CSCs细胞量少，单细胞RNA-序列和500细胞ChIP-seq将最终会解决该问题。单细胞RNA-序列的承诺和挑战已被评估［32］。信号通路之间的相互作用，ncRNAs和组蛋白调节器在调节CSCs起着至关重要的作用。信号通路网络的完全理解，ncRNAs和组蛋白调节器将有利于肿瘤的治疗。

［1］Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，et al.Acell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantationinto SCIDmice［J］.Nature，1994，367（6464）：645-648.

［2］Liu S，Cong Y，Wang D，et al.Breast cancer stem cells transition between epithelialandmesenchymalstatesreflectiveoftheirnormalcounterparts［J］. Stem Cell Reports，2014，2（1）：78-91.

［3］Notta F，Mullighan CG，Wang JC，et al.Evolution of human BCR-ABL1 lymphoblastic leukaemia-initiating cells［J］.Nature，2011，469（7330）：362-367.

［4］Khramtsov AI，Khramtsova GF，Tretiakova M，et al.Wnt/beta-catenin pathway activation is enriched in basal-like breast cancers and predicts poor outcome［J］.Am J Pathol，2010，176（6）：2911-2920.

［5］Monteiro J，Gaspar C，Richer W，et al.Cancer stemness in Wnt-driven mammary tumorigenesis［J］.Carcinogenesis，2014，35（1）：2-13.

［6］Schade B，Lesurf R，Sanguin-Gendreau V，et al.β-Catenin signaling is a critical event in ErbB2-mediated mammary tumor progression［J］.Cancer Res，2013，73（14）：4474-4487.

［7］D′Angelo RC，Ouzounova M，Davis A，et al.Notch reporter activity in breastcancercelllines identifies a subset of cells with stem cell activity［J］. Mol Cancer Ther，2015，14（3）：779-787.

［8］Hassan KA，Wang L，Korkaya H，et al.Notch pathway activity identifies cells with cancer stem cell-like properties and correlates with worse survivalinlungadenocarcinoma［J］.ClinCancerRes，2013，19（8）：1972-1980.

［9］Zhao D，Mo Y，Li MT，et al.NOTCH-induced aldehyde dehydrogenase 1A1 deacetylation promotes breast cancer stem cells［J］.J Clin Invest，2014，124（12）：5453-5465.

［10］Wright MH，Robles AI，Herschkowitz JI，et al.Molecular analysis reveals heterogeneity of mouse mammary tumors conditionally mutant for Brcal［J］. Mol Cancer，2008，7：29.

［11］Kim VN，Han J，Siomi MC.Biogenesis of small RNAs in animals［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（2）：126-139.

［12］Xiong YJ，Fang JH，Yun JP，et al.Effects of microRNA-29 on apoptosis，tumorigenicity，and prognosis of hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2010，51（3）：836-845.

［13］Kim SK，Lee H，Han K，et al.SET7/9 methylation of the pluripotency factor LIN28A is a nucleolar localization mechanism that blocks let-7 biogenesis in human ESCs［J］.Cell Stem Cell，2014，15（6）：735-749.

［14］Iliopoulos D，Lindahl-Allen M，Polytarchou C，et al.Loss of miR-200 inhibition of Suz12 leads to polycomb-mediated repression required for the formation and maintenance of cancer stem cells［J］.Mol Cell，2010，39（5）：761-772.

［15］Liu S，Patel SH，Ginestier C，et al.MicroRNA93 regulates proliferation and differentiation of normal and malignant breast stem cells［J］.PLoS One，2012，8（6）：e1002751.

［16］Yuan JH，Yang F，Wang F，et al.A long noncoding RNA activated by TGF-beta promotes the invasion-metastasis cascade in hepatocellular carcinoma［J］.Cancer Cell，2014，25（5）：666-681.

［17］Wang Y，He L，Du Y，et al.The long noncoding RNA lncTCF7 promotes selfrenewal of human liver cancer stem cells through activation of Wnt signaling［J］.Cell Stem Cell，2015，16（4）：413-425.

［18］Hou P，Zhao Y，Li Z，et al.LincRNA-ROR induces epithelial-to-mesenchymal transition and contributes to breast cancer tumorigenesis and metastasis［J］.Cell Death Dis，2014，5：e1287.

［19］Yamamoto S，Wu ZH，Russnes HG，et al.JARID1B is a luminal lineagedriving oncogene in breast cancer［J］.Cancer Cell，2014，25（6）：762-777.

［20］Wang L，Zhao Z，Meyer MB，et al.CARM1 methylates chromatin remodeling factor BAF155 to enhance tumor progression and metastasis［J］. Cancer Cell，2014，25（1）：21-36.

［21］He J，Shen L，Wan M，et al.Kdm2b maintains murine embryonic stem cell status by recruiting PRC1 complex to CpG islands of developmental genes［J］.Nat Cell Biol，2013，15（4）：373-384.

［22］Kottakis F，Foltopoulou P，Sanidas I，et al.NDY1/KDM2B functions as a master regulator of polycomb complexes and controls self-renewal of breast cancer stem cells［J］.Cancer Res，2014，74（14）：3935-3946.

［23］Michalak EM，Nacerddine K，Pietersen A，et al.Polycomb group gene Ezh2 regulates mammary gland morphogenesis and maintains the luminal progenitor pool［J］.Stem Cells，2013，31（9）：1910-1920.

［24］Kim E，Kim M，Woo DH，et al.Phosphorylation of EZH2 activates STAT3 signaling via STAT3 methylation and promotes tumorigenicity of glioblastoma stem-like cells［J］.Cancer Cell，2013，23（6）：839-852.

［25］Jung HY，Jun S，Lee M，et al.PAF and EZH2 induce Wnt/beta-catenin signaling hyperactivation［J］.Mol Cell，2013，52（2）：193-205.

［26］Zhang M，Wang Y，Jones S，et al.Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors［J］.Nat Genet，2014，46（11）：1170-1172.

［27］Kreso A，van Galen P，Pedley NM，et al.Self-renewal as a therapeutic target in human colorectal cancer［J］.Nat Med，2014，20（1）：29-36.

［28］Neven E，De Schutter TM，Dams G，et al.A magnesium based phosphatebinder reduces vascular calcification without affecting bone in chronic renal failure rats［J］.PLoS One，2014，9（9）：e107067.

［29］Schwartz YB，Pirrotta V.A new world of Polycombs：unexpected partnerships and emerging functions［J］.Nat Rev Genet，2013，14（12）：853-864.［30］Xing Z，Lin A，Li C，et al.lncRNA directs cooperative epigenetic regulationdownstreamofchemokinesignals［J］.Cell，2014，159（5）：1110-1125.

［31］Lara-Astiaso D，Weiner A，Lorenzo-Vivas E，et al.Immunogenetics.Chromatin state dynamics during blood formation［J］.Science，2014，345（6199）：943-949.

［32］Stegle O，Teichmann SA，Marioni JC.Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics［J］.Nat Rev Genet，2015，16（3）：133-145.

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.19.019

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1009-5519（2016）19-2994-04

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