碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制的研究进展

邵闯综述，薛建江审校

（重庆医科大学附属大学城医院检验科，重庆401331）

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制的研究进展

邵闯综述，薛建江△审校

（重庆医科大学附属大学城医院检验科，重庆401331）

克雷伯菌，肺炎；青霉属；碳；抗菌药；药物耐受性；耐药机制；综述

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一类常见的、重要的革兰阴性杆菌，主要存在于人体的上呼吸道和肠道中，当机体免疫力低下或长期大量使用抗生素导致菌群失调时容易引起感染，或者通过患者之间、医护人员与患者间的接触及医疗用具传播，引起呼吸系统、泌尿系统、消化系统等多部位的感染。肺炎克雷伯菌是医院内感染尤其是呼吸道感染的常见条件致病菌之一，近年来已成为仅次于大肠埃希菌的第二大条件致病菌，也是临床上常见的耐药菌之一［1］。本文主要对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）的耐药机制进行综述。

1　肺炎克雷伯菌的耐药现状

随着广谱抗生素的应用，特别是第三代头孢菌素在临床上的广泛、大量应用，引起的医院内感染及耐药日趋严重，临床分离的肺炎克雷伯菌对三代头孢菌素耐药，即产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBLs）阳性率已接近50%，而且其耐药速度正逐年增加。β-内酰胺类抗生素是目前应用最广泛、最普通的抗菌药，对细菌感染的治疗起着重要作用，但其耐药菌株的出现也给临床治疗带来巨大的挑战和困难。自1983年德国报道首例产ESBLs菌株以来，该菌的流行在世界各地已有广泛报道，在短短二十几年中，产ESBLs菌株的分离率急剧增加，其种类已超过200种。

碳青霉烯类抗生素是一类抗菌谱广、抗菌活性强的非典型β-内酰胺类抗菌药物，具有对β-内酰胺酶作用稳定及毒性低等特点；其次，碳青霉烯类抗生素对细菌的靶体蛋白、青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）有良好的选择性，而且和其他β-内酰胺类抗生素几乎无交叉耐药性。因此，碳青霉烯类抗生素已成为产ESBLs和（或）头孢菌素酶（AmpC酶）的多重耐药肠杆菌科细菌感染最有效的抗菌药物，首选于治疗多重耐药菌所致医院内感染，构筑了抗β-内酰胺酶的最后一道屏障。但是，由于近年来碳青霉烯类抗生素在临床上的大量不合理使用，加速了临床上肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药的产生并呈现快速上升趋势，特别是肺炎克雷伯菌尤为明显，即CRKP的出现和传播给临床医生带来了巨大挑战［2］。2013年，CRKP的发生率已达4.3%［3］，而且还在世界范围内引起了暴发流行［4］。

CRKP引起的感染在临床上不但呈增加趋势，而且其耐药性还通过质粒在细菌间传递，不断蔓延、变迁，因此，其耐药问题不容忽视，及早发现并监控CRKP定植或感染，研究其耐药机制的发生与发展，对控制细菌耐药性的发生和传播至关重要。有研究表明，CRKP感染者或无症状携带者均为潜在的感染源［5］。因此，对无症状CRKP携带者进行积极筛查、隔离，可控制CRKP的播散［6］。

2　CRKP的耐药机制

肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要有以下几个方面：（1）产生碳青霉烯酶，可以水解碳青霉烯类抗生素，是其耐药的重要机制之一［7］；（2）高水平产AmpC酶或ESBLs合并外膜孔蛋白（outer membrane proteins，OMP）缺失或表达量下降；（3）碳青霉烯类高亲和位点PBPs的数量下降，对碳青霉烯类抗生素的亲和力下降；（4）主动外排泵系统增强，外排量增多等。其中碳青霉烯酶的产生是最主要的机制［8］。

2．1碳青霉烯酶Ambler分类法根据氨基酸序列的相似程度，将β-内酰胺酶分为A、B、C、D 4类，其中A、B、D类中具有能够水解碳青霉烯活性的酶（即碳青霉烯酶），是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药的最主要机制。

2.1.1A类碳青霉烯酶A类酶因含有丝氨酸残基又被称为丝氨酸酶，目前包括产KPC、SME、IMI、NMC和GES 5种，以产KPC类酶最为常见，各种酶及同一种酶的不同类型对碳青霉烯类的水解活性均有很大差异。

产KPC型碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药的最主要机制。1997年在美国北卡罗来纳州发现了第1珠耐碳青霉烯类抗生素的肺炎克雷伯菌［9］，其可以产KPC-1酶。目前在肺炎克雷伯菌中已发现的产KPC酶有11种类型（KPC 1～11），在国内临床分离的肺炎克雷伯菌中以产KPC-2最为常见［10］，而国外以产KPC-3的检出率较高［11］。自我国2007年发现第1例产KPC酶的肺炎克雷伯菌以来［12］，对碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌的检出率呈上升趋势，给临床治疗带来更多困难。

2.1.2B类碳青霉烯酶B类酶又称作金属β-内酰胺酶，每个酶中均含有至少1个锌离子活性中心，可以水解碳青霉烯类带有β-内酰胺环的多种抗生素，其水解活性不能被克拉维酸和舒巴坦等所抑制，但可以被乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等螯合剂所抑制。目前从肺炎克雷伯菌中检出的B类碳青霉烯酶主要有IMP、VIM和NDM-1等类型［13］。

IMP酶对碳青霉烯类抗生素的水解能力较弱，通常仅携带IMP基因的肺炎克雷伯菌不能对碳青霉烯类抗生素产生耐药。往往在合并了OMP缺失、主动外排泵系统增强等其他耐药机制时，才会对碳青霉烯类抗生素产生高度耐药［14］。目前，IMP酶共有30多个类型，不同国家的流行菌株不具有同源性［15］，主要通过Ⅰ类整合子传播，我国主要以IMP-4和IMP-8较为常见。VIM是金属酶中对碳青霉烯类水解能力较强的一种，目前已报道的类型有30多种，其中以VIM-1最为常见。2003年希腊报道了第1例产VIM-1酶的肺炎克雷伯菌，自此以后其他类型的VIM也相继被检测出来［16］。产VIM-1酶的菌株对头孢菌素类、碳青霉烯类抗生素的敏感性显著下降。VIM基因通过Ⅰ类整合子进行传播，流行范围广，有明显的地域性。NDM-1是在2009年报道的从肺炎克雷伯菌中分离出的新的金属酶基因型，该菌株对几乎所有β-内酰胺类抗生素耐药［16］，仅对替加环素敏感。随后，携带NDM-1基因的肺炎克雷伯菌在很多国家都有报道，其中在亚洲地区较为常见。虽然目前我国分离出该菌的报道并不多见，但还是应提高警惕，避免引起大范围的流行。

2.1.3D类碳青霉烯酶D类酶又称作苯唑西林酶（OXA酶），酶动力学研究显示，该类酶的底物谱狭窄，不能水解广谱头孢菌素和氨曲南，对亚胺培南的亲和力较高，但水解效能较低，其耐药性表现有赖于膜通透性降低等其他耐药机制的协同作用，不能被克拉维酸、他唑巴坦等酶抑制剂抑制［17］。目前报道的OXA酶有200多种，在肺炎克雷伯菌中主要是OXA-48。虽然OXA酶的亚类报道并不多，但其突变的新类型出现速度很快，需要引起一定的重视。

2.2高水平产AmpC酶或ESBLs合并OMP缺失或表达量下降

2.2.1AmpC酶质粒介导的AmpC酶是由肠杆菌属及假单胞菌属等染色体上的AmpC基因通过基因转移方式转移到肺炎克雷伯菌的质粒上，是革兰阴性杆菌产生的又一种重要的酶，该酶使肺炎克雷伯菌能够对头孢他啶等三代头孢菌素类药物耐药，且不能被克拉维酸所抑制。自1988年发现首例质粒介导的AmpC酶MRI-1以来，已发现40余种基因型，主要有ACC、ACT、CMY、DHA等。目前全球流行最多的AmpC酶基因型为CMY-2，主要分布在美国、加拿大和欧洲［18］，我国以DHA-1基因型为主［19］。由于为质粒介导，其具有较快的传播速度和较强的耐药性，因而导致广泛传播，成为临床抗感染治疗的棘手问题。

2.2.2ESBLsESBLs为质粒编码的β-内酰胺酶，是丝氨酸蛋白衍生物，通过水解青霉素、广谱及超广谱头孢菌素及单环β-内酰胺类而导致该类药物耐药，可被β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸钾所抑制。目前在肺炎克雷伯菌中发现的ESBLs主要包括TEM、SHV、CTX-M、OXA、VEB、GES等，其中SHV最为常见［20］。TEM与SHV主要对青霉素、氨苄西林及头孢他啶等一代头孢菌素耐药。在我国主要以CTX-M型最常见。目前用于治疗产ESBLs菌所致感染的药物主要是碳青霉烯类，其中亚胺培南具有高效、超广谱的抗菌活性，是治疗ESBLs菌引起感染的首选药物。

2.2.3OMP缺失或表达下降革兰阴性菌细胞外膜是由许多微孔蛋白组成的孔道，是一种非特异的、能够跨越细胞膜的水溶性扩散通道，一些药物可经通道进入细菌内而发挥作用。大多数抗生素发挥活性抗菌的决定因素不单单取决于外膜的通透性或抗生作用的失活，而是取决于二者之间的平衡。如果OMP缺失或表达下降，抗菌药物则难以进入细胞内或渗入速度减慢，使抗菌药物在渗入过程中被灭活而产生耐药性。肺炎克雷伯菌的孔道蛋白主要有OmpK35、OmpK36和OmpK37，其中Ompk35是细菌发生耐药最主要的膜孔蛋白，OmpK37一般情况下不表达或表达量极少，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳无法检测到。Yang等［21］研究发现，OMP缺失这一单一因素并不能引起肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药，仅能使其对碳青霉烯类药物的耐药性增加，只有当合并了其他耐药机制时才能表现出对其耐药，其中最为常见的机制为高水平产ESBLs或AmpC酶。

2.3PBPsPBPs是细菌细胞膜上的一种蛋白质，因其可与β-内酰胺类抗生素结合而得名。1972年Suginaka等第一次报道了PBPs，他们用放射性同位素标记的方法找到了细菌表面的PBPs［22］。绝大部分细菌都含有PBPs，但不同的细菌所含有的数量、相对分子质量及对β-内酰胺类药物的亲和力不同。它的正常存在是维持细菌形态及功能正常的必要条件，青霉素等正是通过与其结合而抑制细菌细胞壁的生物合成导致细菌死亡，从而起到杀菌作用。PBPs靶蛋白与抗生素的亲和力降低、数量增多或减少及产生新的PBPs均可使抗生素的抗菌作用降低，从而导致耐药。

2.4主动外排泵系统增强主动外排系统是指在肺炎克雷伯菌内膜上的一种蛋白外排泵，它可以通过能量的消耗将进入细菌内的抗菌药物不断的排出细菌外，使其不能发挥抑菌作用［23］。该系统主要由周质融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和药物质子转运子AcrB组成（即AcrAB-TolC系统）。AcrAB-TolC外排泵系统是肺炎克雷伯菌最主要的多重药物外排系统。主动外排泵系统的作用是非专一性的，可以主动排除包括内酰胺类、喹诺酮类和大环内酯类等药物，通常在同一种菌中存在多种主动外排系统，可以导致该细菌对各种结构不同的药物产生耐药，也是使该细菌产生多重耐药的一个机制。有报道指出，主动外排泵系统产生的耐药与该药物对致病菌的膜的通透性相关，当外排系统表达活跃时，细菌对抗菌药物外排系统的外排速度大于其进入细菌内的速度，或者该系统的外排作用使能够进入细菌内发挥抗菌作用的药物极度减少，从而产生耐药；相反，对那些通透性较好的抗菌药，若外排系统的排出速度不足以克服药物内流的速度，则对该药物仍表现出敏感。

2.5整合子整合子是存在于细菌质粒和（或）染色体上的遗传单位，具有基因捕获和表达功能，即是一种天然的克隆和表达系统［22］。1989年Hall首先发现并提出整合子概念，可以在一定条件下被识别和捕获，是携带编码抗菌药物耐药基因盒的DNA片段［26］。研究表明，整合子不仅能通过介导细菌耐药性群聚而产生多重耐药性，而且可以在不同菌种和不同遗传物质间转移，引起耐药基因快速广泛传播［24］。因此，整合子系统介导的细菌耐药性机制引起越来越多研究人员的关注，尤其是针对多重耐药的研究。整合子根据intⅠ基因序列的不同进行分类，迄今发现的含有抗生素耐药基因盒的整合子有5类，而肺炎克雷伯菌中主要含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类。其中Ⅰ类整合子是最早被发现也是最为常见的，从临床分离菌株中发现的整合子大多数属于Ⅰ类。Ⅰ类整合子中含有肺炎克雷伯菌大部分的耐药基因，其在产ESBLs的肺炎克雷伯菌中普遍存在，也是造成多重耐药菌株在医院内暴发流行的主要原因。

3　小结与展望

近年来，随着肺炎克雷伯菌引起的感染率明显增加，大量广谱抗生素的应用导致临床分离的肺炎克雷伯菌耐药情况日趋严重，有些细菌甚至呈多重或广泛耐药。目前出现的对包括碳青霉烯在内的几乎所有β-内酰胺类抗生素耐药的细菌，在临床抗感染治疗中呈现出无药可治的情况，成为棘手的问题［25］。因此，通过肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药机制的研究，尽早采取措施降低患者的感染率和患病率，为医院内感染的防控提供依据，对合理指导临床治疗和多重耐药细菌的筛查、发现和监控具有重要意义。未来应基于对其耐药机制的更深入研究，研制出合理、有效的新型抗菌药，以提高抗感染的成功率。

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（2016-01-30

2016-05-30）