阳离子通道在精子生理及男性生育中的作用研究进展

孙腾达综述，张　超审校（重庆容光医院泌尿外科，重庆401123）

阳离子通道在精子生理及男性生育中的作用研究进展

孙腾达综述，张超审校
（重庆容光医院泌尿外科，重庆401123）

离子通道；精子/生理学；精子获能；不育，男（雄）性；综述

在哺乳动物的精子中表达6个跨膜螺旋重复单位的离子通道样蛋白被命名为精子阳离子通道蛋白。目前，已报道的该家族成员有4个：CatSper1、CatSper2、CatSper3、CatSper4［1-2］。CatSper1基因定位于人染色体11q12.1，CatSper2基因定位于人染色体 15q15.3，Cat Sper3基因定位于人染色体5q31.1，CatSper4基因定位于人染色体 1p35.3。CatSper1最早是在钙（calcium，Ca2+）电压门控通道的同源测序的研究中被发现的，随后发现了其他3个成员［1］。4个蛋白具有高度同源性及相对较低的跨膜区基因序列相似性，相似度为16%～22%。精子阳离子通道基因表达模式表明其在精子生理和生育中具有重要作用。Balderas等［3］研究表明，CatSper1、CatSper2、CatSper3、CatSper4 mRNA表达特异性限于小鼠和人类睾丸组织。采用原位杂交方法研究4个成员的动态表达发现，CatSper2转录发生在生精过程早期（粗线期精母细胞），而CatSper1、CatSper3、CatSper4仅在生精过程末期转录（精细胞）。采用一种更加敏感的检测技术，如实时定量聚合酶链反应也证实了该种表达模式，显示CatSper2在出生后第8天表达，CatSper3、CatSper4在出生后第15天表达，CatSper1在出生后第18天表达［3］。

1　CatSper基本结构

通常情况下一个完整的离子通道是由具有成孔作用的蛋白亚基和一个甚至多个辅助性亚基构成。目前，CatSper亚基尚未被深入研究。由于4个CatSper成员均需要功能性碱性化激活电流的激活作用，因此，其微孔通道被认为是4个CatSper成员形成的四聚体。此外该通道复合体还包含多重跨膜蛋白CatSperB（之前称为CatSperβ）［4］。Chávez等［5］还鉴定了一种新发现的单跨膜蛋白CatSperG，与CatSper复合体相关联。因此，CatSper蛋白复合体至少由3种跨膜蛋白组成，即具有成孔作用和6个跨膜螺旋重复单位的CatSper1～4，一个具有双重跨膜结构的 CatSperB及具有单一跨膜结构的CatSperG。此种结构与其他离子通道，如电压门控性钙离子通道、电压门控性钠离子通道、电压门控性钾离子通道等具有高度的相似性。蛋白纯化后在含有CatSper1蛋白复合体中未鉴定出其他主要蛋白。提示其他蛋白在复合体中或许具有某种功能，但其与CatSper1的结合强度较弱，因此，在蛋白纯化时被丢失。

2　CatSper基因敲除动物模型相关研究

为明确CatSper基因丢失所带来的效应，现有研究已构建了4种CatSper基因敲除小鼠模型。应用CatSper1缺失小鼠精子的研究结果显示，精子的超活化作用发生重要损害而导致不育的表型，此外还导致了去极化作用诱导的Ca2+内流的缺失［6］。Chávez等［5］在一项最初的研究中证实，CatSper蛋白是维持正常精子运动和穿透卵细胞过程所必须的。其制备了CatSper-/-纯合子模型并在光学显微镜下近距离观察了精子运动，发现了正常野生型精子和基因缺失精子之间的巨大差异。正常小鼠精子尾部呈有力的鞭打样及持续前向运动；相反CatSper基因敲除小鼠精子则表现为运动迟缓及极少定向运动。尤其突出的是该类精子尾部缺乏有力鞭打样运动和弯曲度。计算机辅助精子运动分析显示，基因敲除小鼠精子的重要运动参数，如平均路径速度、直线速度、曲线速度等均明显受损，表明CatSper基因缺失可导致精子运动能力显著降低。该研究同时在体外受精实验中检测了CatSper缺失精子的受精能力，CatSper缺失精子不能使卵子受精，反之未敲除CatSper基因精子可使81%卵子受精。尽管有些CatSper缺失精子可黏附在卵子上，但似乎并不能穿透透明带，可能与其运动性能降低有关。在正常自然受精过程中精子需穿透卵子透明带蛋白的外周层并与卵细胞质膜相结合。为检测基因敲除精子是否保留了与卵子质膜相结合及激活受精作用的能力，将基因敲除精子及未敲除基因精子与用酶去除透明带的卵细胞一起孵育，在此种条件下2种精子均可使卵子受精，说明CatSper对精子穿透卵子的外层是非常必需的，但对卵子的激活并非必须。

用基因敲除小鼠进行的相关实验证实，CatSper1及CatSper2对精子超活化至关重要［7］。雄性小鼠不管是CatSper1基因缺失还是CatSper2基因缺失均会导致生育功能的完全丧失。且CatSper1、CatSper2缺失的精子在获能环境下均不能超活化。与此相似，CatSper3、CatSper4缺失的成年纯合子雄性小鼠与成年野生型雌性小鼠交配并未生产任何后代，尽管其拥有正常的交配行为。然而其同窝出生的杂合子小鼠却能产生正常数量的子代和具有正常的产仔间隔［8］。CatSper3-/-、CatSper4-/-缺失的纯合子小鼠也完全不育，尽管其精子计数及最初运动功能均正常。在获能介质中未敲除CatSper2基因精子在室温孵育30 min后发生超活化作用，而CatSper3 或CatSper4缺失的精子在孵育2 h后仍表现为最初的运动形式。提示在精子获能过程中功能性CatSper3、CatSper4蛋白是精子超活化所必需的［9］。有趣的是当未敲除CatSper2基因精子置于无Ca2+介质中时15 min内运动便消失，而CatSper3、CatSper4基因缺失精子仍然表现为较弱的最初运动，提示CatSper3、CatSper4缺失时精子的最初运动可在胞外无Ca2+时仍然得以维持。

在对基因敲除小鼠的详尽评估后作者归纳了导致雄性不育的3条重要因素：（1）运动性快速丧失，明显减低了CatSper3、CatSper4蛋白缺失精子到达输卵管壶腹部与卵子相遇的数量；（2）CatSper3、CatSper4缺失精子不能穿过黏液介质，提示这些基因突变的精子在雌性生殖道的黏液内不能有效行进，因此，抵达卵子所在部位的精子量将会大大减少；（3）超活化的缺失将使突变精子在受精过程中难以产生足够前进动力以穿透卵丘细胞和透明带［10-11］。这一发现提示，功能性CatSper3、CatSper4蛋白是维持精子运动能力和产生穿透卵细胞外层的动力来源所必需的。

如上所述，在CatSper3-/-、CatSper4-/-纯合子小鼠中精子运动功能的丧失与CatSper1-/-、CatSper2-/-纯合子小鼠极为相似。可见4种CatSper蛋白的任何一种缺失均会在获能环境中呈现超活化运动缺乏和最初运动能力的快速丧失。在小鼠中缺失4种CatSper通道蛋白中任何一种均出现几乎相同的表型［12］。其高度同源的结构域及相似的精子鞭毛定位均提示CatSpers 1～4形成一个阳离子通道聚合体，该阳离子通道聚合体是精子在雌性生殖道中激发超活化运动所必需的。有趣的是Sutovsky［13］研究已表明，4种CatSper蛋白事实上是相互关联的，且可形成四聚体；另一方面CatSpers基因缺失的雌性小鼠则具有正常的生育功能，且与未敲除雌性小鼠比较，未发现产仔数和产仔间隔的差异。

3　CatSper可能扮演孕酮（黄体酶）受体角色

在输卵管内包绕卵母细胞的卵丘细胞释放的孕酮可使人精子Ca2+水平急速上升。孕酮诱导Ca2+内流，进入精子内，引起精子的获能、超活化及趋化作用和顶体反应［6，14-15］。利用膜片钳技术分析人类成熟精子结果发现，纳摩尔浓度的孕酮就能显著提高CatSper的通道能力，证明孕酮能强力激发精子鞭毛上的主要钙离子通道——CatSper，从而使其鞭毛摆动加快。作为一种卵巢激素，孕酮通常经孕酮核受体调节基因的表达而发挥作用。然而孕酮在转录沉默的精子方面的效应尚未得到解释，相信是通过一种特异的非基因组的膜孕激素受体而发挥作用［14］。在人精子中孕酮激活的Ca2+内流并不涉及通过核受体的经典转录调节模式。目前，已发现了多种孕酮可能的膜受体包括一种新近发现的G偶联的孕酮受体和一个单通道受体（孕酮受体膜成分）。非基因组孕酮受体的下游通路推测涉及腺苷环磷酸和鸟苷环磷酸、蛋白激酶A和G、细胞内池内Ca2+的释放、细胞内池操控的Ca2+通道和鸟苷环磷酸激活通道。

CatSper通道也许扮演了一种新型孕酮受体的角色，调控孕酮在精子质膜层面上快速的、非基因组水平的效应。具体而言，CatSper收到孕酮信号后与孕酮结合，通道打开，这样Ca2+就可进入精子内，从而引发鞭毛摆动加快。孕酮是从卵细胞周围释放出来的，因此，随着孕酮的释放，这种信号就形成一个浓度梯度，精子通过Cat Sper接收信号，越靠近卵子，孕酮水平越高，精子游动越快，最后到达卵细胞，与卵细胞融合。这种浓度梯度为精子的准确定位提供了可靠信息。

已有研究显示，人CatSper的效应可被前列腺素激活增强，显然这是通过孕酮结合位点以外的结合位点而发挥作用的；CatSper或一种与其直接关联的蛋白充当精子上非基因组的孕酮受体，该受体是精子特异性的，结构上不同于基因组孕酮受体。这一发现代表了一种开发新型非激素类避孕药物的有前景的新靶点［16］。根据使用全细胞膜片钳技术的研究结果显示，具有较弱电压依赖性和PH敏感性的CatSper是唯一出现于鼠和人精子中具有稳定活性的Ca2+的“调度者”。通过CatSper的Ca2+内流激活精子超活化作用，CatSper也通常被认为具有控制精子趋化性的作用，因为引导精子朝着卵细胞的“趋化运动”依赖于Ca2+内流入鞭毛而激发的非对称性鞭毛运动。由CatSper通道介导的鞭毛Ca2+内流甚至导致精子头部Ca2+水平升高（可能是由于位于精子颈部细胞内池的Ca2+依赖性的Ca2+释放），由此而促成Ca2+依赖性顶体反应［17］。

4　CatSper基因突变的相关研究

在人类中的CatSper基因突变研究较少，仅有的Cat Sper2基因突变的研究已证实，与无症状的男性不育有关。人类其他的CatSper基因突变尚有待于进一步研究。周密设计人类研究将可能鉴定不育个体中究竟是这种还是其他CatSper基因发生了突变。正如前所述，Cat Sper不仅为精子运动和超活化所必需的，且在精子对卵细胞的穿透过程中不可或缺。因此，不管是弱精症或正常精子不育个体均是人类基因突变研究的理想载体。因为由孕酮激活的CatSper通道可引起所有3种Ca2+依赖性反应，即超活化、趋化作用及顶体反应［18］。CatSper通道抑制剂的鉴定将极大促进精子Ca2+信号转导的研究及进一步帮助确定孕酮和CatSper的生理学作用。反过来，在不育人群中对CatSper基因突变的鉴定可进一步促进CatSper抑制剂的开发。

5　小结与展望

离子通道对精子运动、精子活化、顶体反应及受精过程中的趋卵运动十分重要。CatSper基因在精子超活化中的作用已有较好的研究。但每个家族的特定通道的特定角色和特点功能尚不明确。精子阳离子通道的无效突变动物模型已建立，其大部分表现为生育能力降低包括运动能力减低、超活化丧失或受精能力丢失，尽管其拥有正常的精液参数。动物模型研究已证实，阳离子通道不可或缺的作用，但像CatSper2基因那样的不育人群的突变筛选研究并未引起足够的重视。阳离子通道在正常和非正常精子的生精、成熟、获能和顶体反应过程中的分子信号传递过程尚需进一步研究。将有助于明确那些病因不明的不育人群的病因。此外阳离子通道家族的确定角色及其配体/信号分子尚有待于进一步确定。在该类信号转导通路中阳离子通道角色的确定可进一步理解精子生理和确定受孕时间或避孕。分子特征的描述和不育个体中离子通道的筛选将在动物实验中进一步说明其在男性不育中的准确意义。弱精症和精子正常不育个体因为其精子可能有相应的功能缺失而成为理想的筛选个体［19-22］。对精子阳离子通道引导精子运动和决定其生育的研究可为发现男性避孕药物和治愈不孕提供最重要的研究方向。

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