沙打旺愈伤组织再分化及植株形成的研究进展

王未祥，高建民，张爱东，张琼琳，王海霞，孙 杰

（1.内蒙古大学，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古赤峰市草原工作站，内蒙古 赤峰 024000；3.内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

沙打旺愈伤组织再分化及植株形成的研究进展

王未祥1，高建民1，张爱东2，张琼琳3，王海霞3，孙 杰3

（1.内蒙古大学，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古赤峰市草原工作站，内蒙古 赤峰 024000；3.内蒙古农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

从实验材料的基因型、生理状态、培养条件和操作方法等方面介绍了沙打旺愈伤组织再分化及植株形成的研究进展，以期为培育能够适应北方高原寒冷气候的、具有优良性状的沙打旺品种提供有益参考。

沙打旺；组织培养；生物技术

沙打旺（Astragalus adsurgens）属豆科黄芪属多年生草本植物，又名直立黄芪、麻豆秧。其耐干旱耐盐碱，适应性强，是我国特有的适用于改良荒山和固沙的优良牧草。作为具有水土保持和绿肥等兼用型的牧草，其优点是生产力高、抗逆性强，并具有固沙能力等。由于沙达旺的生育期长且兼有自花授粉和异花授粉的习性，导致其花期不集中，最终造成种子的质量很差，产量较低，直接影响了其推广与应用。

沙打旺作为饲料具有很高的营养价值，可直接作为骆驼、猪、兔子、马、牛、羊等牲畜的饲料。其可制成干草、青贮和发酵饲料等喂饲，也可割草喂饲。沙打旺不仅可以直接压青作基肥和异地压青作追肥，而且其秸秆可以制作堆肥和沤肥。此外，在黄河周边等风沙面积较大的地区种植沙打旺，可以减少风沙危害、防止水土流失、改良土壤和保护果林。

目前，组织培养技术已在很多生物技术中成为必不可少的一项重要环节，组织培养是植物遗传转化操作的基础步骤。为了使沙打旺适应北方高原的寒冷气候，可利用高品质、生育期短的品种通过组织培养的手段进行探索。而影响沙打旺愈伤组织再分化及植株形成的因素可能与外植体的材料、培养基等的选择有关。

1 外植体材料

1.1 品种基因型 植株的再生频率在很大程度上受植物基因型的影响。供体植株所处的环境条件和其本身含有的某些化学物质造成了不同基因型之间再生频率的差异。有人认为，不同基因型植株产生的内在化学物质的量不同且受到内在化学物质的抑制程度不同，导致植株再生的难易程度不同［1］。也有人认为，不同品种材料的内源激素含量不同，导致植株的分化频率和分化速度不同［2］。但大多数人认为，再生频率的差异与植株基因的作用有关。覃建兵等［3］对不同基因型小麦的愈伤组织进行诱导，结果显示，成熟胚愈伤组织的诱导、绿苗的再生以及根的分化都存在显著的基因型效应，证实了梁竹青等［4］关于“相同外植体的诱导分化是受基因型控制的一种性状”的论断。有研究指出，在相同的诱导条件下，诱导出的不同品种沙打旺的愈伤组织具有显著差异。愈伤组织经诱导培养后，不同基因型的外植体愈伤组织形成能力存在明显差异。这是因为不同品种具有不同的遗传学特性，其决定了该品种生长过程中不同的生化机制，造成了不同的外植体状态。不同的外植体状态对培养基和培养条件的反应不同，从而使形成的愈伤组织和细胞形态不同，最终对植株根和芽的分化造成了影响。基因型的差异造成了不同的出愈率和愈伤质量，进一步证实了愈伤组织的诱导与基因型的选择密切相关。因此，可以提取不同品种沙打旺的RNA，利用高通量测序方法，分析影响沙打旺植株再生能力的基因，并设计相关试验对其进行验证，为提高组织培养的成功率提供重要的遗传学基础。

1.2 不同器官外植体 同一植株的不同器官对诱导条件的反应有明显差异，某些部位诱导分化的成功率很高，而有些部位却很难脱分化，即使能够脱分化其再分化频率也很低。Vander等认为，以成熟种子为外植体材料进行组织培养，其诱导产生的愈伤组织再生植株的频率明显比以幼穗为外植体材料低，认为幼穗是诱导胚性愈伤组织的最好外植体［5］。一些国内外学者通过对相同植株不同器官的组织培养进行研究，发现植株的幼穗、茎段、花序、未成熟胚和成熟种子等都可以用于诱导愈伤组织，但是植株的不同器官，其诱导能力不同。幼穗和未成熟胚的出愈率和愈伤组织的分化率较高，茎段和花序的出愈率和愈伤组织的分化率较低。在同样的培养条件下，不同器官即使都能诱导出愈伤组织，但是只有幼穗愈伤组织能够继续分化出再生植株［6］。由此可知，合适的外植体也是影响组织培养能否成功的关键因素之一。研究已知，植株不同部位上的同一种器官，具有不同的再生能力。众所周知，从植物的生态学上端由下往上可知，位于基部的器官，其幼年组织的形态发生能力与老年组织相比更强，而位于顶端的器官，其生长发育时间短，但是生理年龄却相当老，其发育更成熟，易于花器官的形成。研究表明，能产生淡黄色致密愈伤组织的器官是小花分化前的幼穗（1～3mm），且产生愈伤组织的时间及质量在大于2mm的各部位差异显著。产生愈伤组织时间最短且生长最快的是位于幼穗中部的小花，其能进行多次的继代培养，而产生愈伤组织时间最长的是小花顶端，其具有疏松的愈伤组织。而不产生愈伤组织的是比较大的幼穗，因此幼穗发育时期的大小能影响愈伤组织的质量和诱导率。

事实证明，体细胞胚的产生受植株外植体发育程度和生理状态的影响，诱导体细胞胚产生的最好的组织为分化程度较低而生理代谢旺盛的组织。因此，不同外植体产生愈伤组织所需的时间不同，产生愈伤组织的百分率也因不同外植体而异。有研究表明，下胚轴、子叶在分化培养基上产生愈伤组织的平均百分率较高，而外植体采用根的诱导率较低。这也证实了愈伤组织的产生与生理状态不同的植物器官对组织培养存在影响，脱分化能力的大小与同一种植物不同外植体有关，因此，沙打旺组织培养要选择合适的外植体。

植株不同部位的器官其再生能力和生理状态有明显的不同，愈伤组织及体细胞胚的形成发育能力与不同外植体的选择有关。但部分外植体取材困难和季节限制不能周年供应等因素都会影响沙打旺组织培养的研究工作。近年来，许多学者都利用沙打旺的叶片和芽尖进行组织培养，但是还需要进一步完善培养条件才能提高植株再生的频率。

2 培养基

培养基是外植体生长的营养物质来源，沙打旺愈伤组织的形成、细胞培养和植株再生都需要培养基中的某些化学成分，因此，选择合适的培养基能够促进沙打旺愈伤组织的再分化和植株的再生。

2.1 基本培养基 MS培养基和N6培养基是组织培养中最常用的2种培养基，这2种培养基都有各自的优缺点。首先，MS培养基中铵盐和硝酸盐等无机盐的浓度较高，因此不需要添加更多的有机附加物，就能满足沙打旺对各营养元素的需求，能够加速其愈伤组织的生长和再分化，但外植体褐变往往是由培养基中的盐浓度过高所导致［7］。N6培养基含有大量的 KNO3和（NH4）2SO4，但是不含有钼，高浓度的NH4NO3对培养基中的植株再生至关重要，有时可作为植物生长调节剂使用。使用不同种类的基本培养基可能对沙打旺愈伤组织的形成和植株再生产生不同的影响。

2.2 植物生长调节物质 植物生长调节物质是组织培养中不可缺少的外源激素，其主要有2，4-D、6-BA、KT、ZT、NAA、kin 等，这些物质能够影响愈伤组织的再分化和植株的再生。不同种类和浓度的植物生长调节物质对外植体诱导形成根和芽的影响不同。因此，愈伤组织诱导成败的关键在于培养条件中植物生长调节剂的种类和浓度，而不是外植体的来源和种类。植物生长调节物质对沙打旺愈伤组织的形成和植株的再生能力具有提高作用，需要通过试验来验证其最适合的种类和浓度。

2.2.1 2，4-D对愈伤组织诱导的作用：2，4-D属生长素类植物生长调节剂，是多种植物愈伤组织的诱导脱分化所必需的。有研究表明，2，4-D可改变花粉原来的正常发育途径。而且2，4-D能影响植株基因的表达，其与染色质中的组蛋白相结合，使组蛋白脱离DNA链，促使DNA链活化，导致大量的DNA复制，细胞进行连续的分裂，最终形成愈伤组织，从而控制植株愈伤组织再分化植株的再生。因此，不同浓度的2，4-D可以造成植株愈伤组织再分化难易程度的不同。

单独使用含2，4-D的培养基对愈伤组织的诱导效果显著。研究已知，在使用不含2，4-D的4种培养基（MS、1/2MS、N6、1/2N6）对幼胚进行培养时，幼胚萌发率最高的是N6培养基，而将2，4-D加入培养基后，幼胚萌发率骤减；在接种第4天便可发生脱分化，产生愈伤组织，少量脱分化组织里出现再生芽［8］。

尽管较高浓度的2，4-D有利于胚性愈伤组织的诱导，但在一定程度上2，4-D也是促使愈伤组织褐化的一个重要因素［9］。在对只有2，4-D的培养基与不加任何激素的MS培养基的对比研究中发现，在含有2，4-D的培养基中细胞分裂素氧化酶和IAA氧化酶的活性明显降低，造成愈伤组织不能正常生长和分化，而且愈伤组织出现的褐化和水化现象可能是由于培养基中2，4-D的存在以及生长素类似物在整个培养系统中始终处于高浓度的状态。研究证实，培养基中高浓度生长素导致愈伤组织褐化的原因是其诱导愈伤组织内多酚氧化酶活性升高。因此，为减少组织培养中的无性系变异，诱导时应用的生长素浓度通常为0.5～12 mg/L。

2，4-D也经常与其他植物生长素类或细胞分裂素类物质一起使用来进行植物愈伤组织的诱导。生长素类和细胞分裂素类的不同配比对植物愈伤组织诱导影响差异不同。当2，4-D和6-BA配合使用时，出现淡黄色、颗粒状愈伤组织形态的比例较单独使用2，4-D时高。而且，在诱导愈伤组织中，较高含量的细胞分裂素会在一定程度上抑制愈伤组织的形成，因此生长素类物质的作用显得更为重要。周宜君等［10］研究表明，不同比例的2，4-D与6-BA对部分植物诱导愈伤组织出愈率的影响存在差异。但是，不同浓度的2，4-D对沙打旺愈伤组织的形成是否同其他植株一样，尚未有研究报道。

2.2.2 NAA对愈伤组织诱导的作用：研究证实，在诱导愈伤组织时，NAA的效果优于2，4-D，且无论其与哪一种细胞分裂素类物质同时使用，都能够产生100%的愈伤组织诱导率。研究表明，生长调节剂对芦荟的诱导效果为 6-BA＞IBA＞2，4-D＞NAA，而对萝卜愈伤组织的诱导效果为 NAA＞2，4-D＞IBA［11］。在单独使用NAA对杜仲幼叶愈伤组织进行诱导时，取得了100%的诱导率。NAA与2，4-D和6-BA的配比使用对植物愈伤组织的诱导也有显著效果。NAA在诱导植物愈伤组织过程中的一般使用浓度范围为0.05～20 mg/L。NAA对沙打旺愈伤组织诱导率的影响有待研究证实。

2.3 琼脂 琼脂是培养基的基本组分，在固体培养基中是必不可少的。琼脂在凝固过程中使营养物质包含于琼脂内。沙打旺可处于培养基表面，既能吸收必需的养分和水分，又不会因缺氧而死亡。增加培养基中的琼脂含量可以提高正常试管苗与玻璃苗的比率［12］。

2.4 蛋白水解物 有研究证实，蛋白水解物能启动胚性愈伤组织形成。研究发现，一些禾本科植物中的脯氨酸和谷氨酰胺在组织培养中能诱导胚性愈伤组织的产生。愈伤组织的质量和再生率的提高是由于水解酪蛋白的存在，而能诱导未成熟胚愈伤组织的是酪蛋白水解物、脯氨酸和肌醇等有机物，但是这些有机物对成熟种子愈伤组织的诱导可产生不利影响。因此，可添加有机物促进芽尖和叶片等外植体愈伤组织的再分化。黑麦草的组培试验表明，高浓度的氨基酸添加物与对照相比并没有改善植株的再生率。因此，在沙打旺的组织培养中如何正确合理地使用这些氨基酸添加物还需进一步研究。

2.5 碳水化合物 蔗糖是配制培养基时最常用的碳水化合物。因为蔗糖不仅可以作为碳源为植物提供有机碳，而且其浓度的改变会直接影响培养基的渗透压。胚性愈伤组织的形成和植株再生不仅需要在培养基中加入适量的植物激素和蛋白水解物，而且还需要加入适当的碳水化合物。在对紫羊茅愈伤组织进行长期培养和悬浮培养时发现，蔗糖浓度的增加会提高植株的再生能力，降低白化苗的数量。国外学者研究表明，在培养基中加入凝胶和碳水化合物，能明显提高黑麦草胚性愈伤组织的形成。国内学者研究表明，蔗糖对黑麦草的分化有显著的影响，黑麦草分化所需的蔗糖比例最低为3%。在培养基中提高蔗糖和琼脂浓度，愈伤组织状态能发生改善，这样会促进胚性愈伤组织的发生与植株再生。刘文真等［13］研究表明，蔗糖的使用提高了多年生黑麦草的再生频率。以上研究表明，高浓度的蔗糖有利于提高植株再生频率，可促进胚性愈伤组织的发生。因此，在沙打旺的组织培养过程中可以使用合适的蔗糖浓度以促进愈伤组织的发生和植株的再生。

3 愈伤组织再生植株的组织学研究

沙打旺的愈伤组织可分为3种类型：Ⅰ型，组织结构紧密，形态复杂多样，细胞生长缓慢，产生较少的胚状体，其通过器官发生途径再生，不易长期继代；Ⅱ型，组织结构松散，呈颗粒状，细胞生长较快，通过胚状体途径再生，在长期继代培养中仍有胚性；Ⅲ型，组织结构黏软，形状呈水浸状，细胞颜色为白色透明或半透明，该种组织已丧失了分化能力，但是继代培养容易，是非胚性愈伤组织。这3种愈伤组织类型中Ⅱ型和Ⅲ型愈伤组织是非胚性的，而Ⅰ型愈伤组织是胚性的。因此，为了提高植株的再生能力，需要控制形成Ⅰ型愈伤组织。

3.1 芽分化的组织学 沙打旺愈伤组织表面的分生细胞在大量分裂后，其表面开始变得平滑，且垂周分裂的表层细胞形成只有一层细胞的原套，使其明显与愈伤组织形成隔离。表层下的细胞形成原体，向四周进行分裂。原套、原体与正常芽的分化基本相同，在生长锥的表层、侧面及表层下的细胞分裂加快，突起形成叶原基。分生组织带的形成在叶原基下［14］。原表皮和原形成层由沙打旺的生长锥内分化而出。原形成层来源于苗端分生组织，而拟形成层来源于愈伤组织中的薄壁细胞。原形成层进一步分化形成维管组织是在芽端向上生长、分化过程中发生的。一个完整的芽是在芽分化位置的下方，由原形成层分化的维管组织与愈伤组织中的维管组织结节的拟形成层连接起来而形成的。最终，形成一个类似壳状的维管组织团。这个结节团的中央是由薄壁细胞构成的“髓”，其次是木质部、形成层、韧皮部。芽的其他分化方式还包括首先形成许多叶状体，然后叶状体的表面个别细胞启动，形成分生细胞，最后分化成芽。

3.2 根分化的组织学 植物茎中维管束可排列形成环状。孙辉等［15］研究表明，将再生幼苗的茎切断插入生根培养基中，第3天时，维管束间的薄壁细胞及靠近韧皮部的薄壁细胞中的个别细胞脱分化，呈现分生细胞状，其中有些细胞已开始分裂；第4天时，已分裂的细胞形成不定根原基，开始向外突起；第5天时，不定根原基开始出现层状的规则结构，不定根原基原分生组织由每一层的原始细胞及其部分衍生细胞所构成；第6天时，原表皮、基本分生组织、原形成层根冠明显生成，表明根的初生分生组织已基本形成；最后，根尖端从茎皮层开始突破。在根的产生过程中，有部分脱分化细胞在茎皮层中产生，且这部分细胞分裂后可形成少量的愈伤组织，无其他组织分化，仅有薄壁细胞。根原形成层继续分化的维管组织与原茎的维管组织联系起来，构成完整的维管组织系统，达到结构与功能的统一［16］。

4 生物技术

植物生物技术育种的基础是组织培养（包括细胞培养）。目前已有大量关于牧草的组织培养和诱导植株再生方面的研究。在牧草育种方面，已被应用的组织培养技术有微体繁殖及人工种子，幼胚培养，花药培养，单倍体利用，种质资源保存，体细胞无性系变异及其离体选择等［17］。为建立牧草基因转化技术系统，要有计划地选择牧草品种，提取目的基因（或引进），构建载体（或引进），开发有效的适合牧草特点的基因转化技术，同时还要进一步研究外源基因直接转化的方法［18］。

根据牧草的特点和育种的需求，利用基因工程技术不仅可以实现抗病虫、抗旱、耐盐碱、高蛋白、耐寒、固氮等高难度的育种目标，而且可以通过将外源基因转入供体植株的方式，改变植株的再生能力，增强愈伤组织再分化的能力，提高组织培养的成功率，且导入外源基因的供体植株仍然可以再成为供体，从而形成良好的循环。因此，可以使用转基因技术来提高沙打旺愈伤组织的再分化能力。

牧草生物技术的关键是植物再生体系的确立，一个良好的再生体系可以极大地缩短转基因育种年限，提高育种成功率［19］。植物基因转化的受体系统主要来源于组织培养。作为基因转化的受体系统，应具有稳定的外植体来源、较高的遗传稳定性、较强的再生能力，应对选择性抗生素敏感，对农杆菌侵染敏感等［20］。植物遗传转化的重要条件是建立高效的组织培养再生体系。而有关牧草组织培养的研究较少，再生体系的建立相对较难，很大程度上制约了牧草的遗传转化研究。因此，建立高效的组织培养再生体系势在必行［21］。

沙打旺原生质体再生植株实验体系的建立，使得利用细胞遗传操作技术改良沙打旺的不良性状变为现实。再生体系的建立不仅可以研究植物体细胞胚胎发生的分子机理，而且可以通过利用TDNA插入标记或转座子标签技术来筛选沙打旺体细胞胚胎发育突变体。

5 小结

在组织培养中，影响沙打旺愈伤组织再分化和植株再生的因素是方方面面的。为提高植株的再生能力，应综合考虑各方面的因素，继续将生物技术引入牧草培养中，以获得最高的再生率。为进一步提高经济效益，应系统化地开展研究，使之规模化生产，以开发牧草产品的二次经济价值。

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Research Progress on Callus Redifferentiation and Plantlet Formation of Astragalus adsurgens

WANG Wei-xiang1，GAO Jian-min1，ZHANG Ai-dong2，ZHANG Qiong-lin3，WANG Hai-xia3，SUN Jie3
（1.Inner Mongolia University，Hohhot 010010，China；2.Chifeng Municipal Grassland Working Station of Inner Mongolia，Chifeng 024000，China；3.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Husbandry Sciences，Hohhot 010031，China）

We introduced the research progress on callus redifferentiation and plantlet formation of Astragalus adsurgens in the aspects of genotype,physiological state,culture condition and operation method of experimental materials,so as to provide references for the cultivation of new Astragalus adsurgens variety with fine traits and adaptability to the cold climate of northern plateau.

Astragalus adsurgens；tissue culture；biotechnology

S541

A文章顺序编号：1672-5190（2016）08-0030-05

2016－07－15

项目来源：内蒙古农牧业创新基金项目“农牧业生物技术应用研究——高蛋白低木质素沙打旺新品种（系）的创新”（2011CXJJM01）。

王未祥（1993—），男，所学专业为园艺。

孙杰（1963—），女，研究员，博士，主要研究方向为草业科学。

（责任编辑： 赵俊利）