骨组织工程研究现状及临床应用*

冯刚　肖东琴

(南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所，四川 南充 637000)



·专家述评·

骨组织工程研究现状及临床应用*

冯刚肖东琴

(南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院组织工程与干细胞研究所，四川 南充 637000)

自20世纪80年代提出组织工程的概念以来，骨组织工程在基础研究方面取得了巨大进展。但要正式大规模应用于临床还存在许多困难和挑战。本文主要从支架材料、种子细胞、组织构建及临床初步应用四方面对骨组织工程的基础研究现状及临床应用做一述评，期望骨组织工程的发展将推动组织工程骨产品的临床应用，并造福广大患者。

骨组织工程；支架；种子细胞；临床应用

执行编委简介：冯刚，男，医学博士，南充市中心医院副院长，《西部医学》副主编。川北医学院组织工程与干细胞研究所、南充市中心医院生物治疗中心主任，教授，硕士生导师。四川省“千人计划”特聘专家，四川省学术和技术带头人，四川省杰出青年学科带头人资助人选，四川省医学会骨科专委会委员。主要从事骨及软骨组织工程，椎间盘退行性变疾病的生物治疗及肿瘤生物治疗等研究。主持国家“973”项目子课题1项、国家自然科学基金项目4项、军队“九五”和“十五”重点课题以及省部级科研课题多项。先后获得军队科技进步二等奖、四川省医学科技奖二等奖、南充市科技进步一等奖、二等奖各1项。在国内外发表学术论文80余篇，申请国家发明专利3项。E-mail：genecloner@163.com

随着社会经济发展以及车辆的迅猛增长，创伤、感染、肿瘤及先天性疾病等原因造成的骨缺损尤其是大段骨缺损(内径>5 mm)，使人们对骨修复体的需求量呈现快速增长。目前，自体骨移植作为骨缺损修复的金标准，至今仍是临床最常用及最有效的骨修复方法。由于其来源及二次手术等问题，限制了大规模应用，同种异体骨和异种同体骨的使用也存在免疫排斥及病原传染等危险。因此，骨组织工程应运而生，其利用组织工程技术体外构建或在体移植具有生物学功能的组织工程骨，为骨缺损患者带来新的希望，是目前公认用于大段骨缺损修复的理想方法。因骨组织结构、功能相对简单，在组织工程领域发展最为迅速，被认为是目前最快能获得实际应用的领域[1]。近20余年来随着人们对支架材料、种子细胞、组织构建及临床初步应用研究的深入，出现了一系列可喜的研究成果。本文就国内外骨组织工程的研究现状及临床应用作一述评。

1　骨组织工程支架材料的研究

体外构建组织工程骨过程中，支架材料作为细胞外基质替代物，起着引导细胞生长、血管长入及营养物质传输的重要作用，也是支撑细胞迁移生长形成立体组织的关键所在。理想的骨移植支架材料应具有三维贯通多孔结构，良好的生物相容性、生物降解性能及适宜的机械强度。目前，在骨组织工程中研究较多的支架材料主要有天然支架材料、人工合成的支架材料以及复合材料。

天然生物衍生材料如胶原、藻酸盐及壳聚糖等，具有良好的生物相容性，是较为理想的细胞外基质替代材料[2-4]。因力学强度差及降解速度难以控制等缺点，使其单独作为支架材料的前景不佳。此外，对异体骨经过脱脂、脱矿、消毒及冻干等处理获得的脱钙骨基质，保留了骨优良的立体多孔结构，具有良好的骨诱导性及骨传导性，为种子细胞的黏附、生长提供了良好的生长环境，临床常与成骨活性物质复合移植到病人体内[5]。但经过脱矿处理，造成机械强度下降，其免疫原性仍是难以克服的问题。

采用物理化学方法合成的人工支架材料，来源广泛，能够有效避免天然支架材料存在的免疫原及传播潜在性疾病的风险。人工高分子材料以聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物均具有良好的可塑性且降解速率可控[6]，但表面缺乏细胞识别信号，体内降解产物易诱发炎症反应及力学强度不足等问题，使其不能成为理想的骨组织工程支架材料。而人工合成的无机非金属材料，以羟基磷灰石和磷酸三钙陶瓷材料应用最为广泛[7-8]。羟基磷灰石作为人体硬组织的主要无机成分，因其良好的生物相容性和骨传导性被广泛应用于骨缺损和牙科修补。但其脆性大、难降解，导致其单独使用受到限制。而磷酸三钙也存在机械强度差、降解速率过快等问题。此外，不锈钢和钛合金等作为骨科临床常用的金属材料，不能降解，需要二次手术取出，且较高的弹性模量产生应力屏蔽，易导致骨质疏松等并发症的发生。而镁作为可降解金属材料，重量轻、密度小，其弹性模量(45 GPa)更接近于正常骨组织，且无需二次手术，这些特性使镁及其合金成为极有应用前景的新型骨组织工程材料。然而其体内降解速率过快，产生大量氢气，导致体内研究的失败[9]。因此，对镁进行改性，调控镁的降解速率使其与骨组织生长速率相匹配是目前研究的热点。Fischerauer等采用微弧氧化的方法对镁支架进行改性，植入动物体内一周后，几乎未见镁支架降解，支架与周围组织结合良好[10]。但三周后发现支架与未改性支架相比，降解速率加快。微弧改性的方法虽然延缓了支架起始的降解速率，但支架比表面积的增大也加速了后期支架的降解。

鉴于单一类型支架材料存在各自的缺陷，不能满足骨缺损修复的需求，因此，结合不同类型材料的优势，开发复合材料用于骨组织工程势在必行。目前，常用的复合材料主要有生物陶瓷材料的复合、生物陶瓷与高分子材料的复合、金属与陶瓷材料的复合以及金属与高分子材料的复合等。其中结合羟基磷灰石良好的生物活性及β-磷酸钙三钙吸收降解性能合成的双相磷酸钙(BCP)骨修复生物陶瓷作为商业化产品在美国、日本及欧洲等国家得到广泛应用[11]。多孔BCP生物陶瓷作为骨组织工程支架可通过调节HA/β-TCP比例控制降解速率，使材料的降解速率与组织细胞生长速率相适应，且其降解产物钙、磷离子的释放有利于类骨磷灰石的沉积，促进新骨形成,且能与骨组织形成化学键合。此外，将羟基磷灰石与镁支架结合，在镁支架表面制备羟基磷灰石涂层，既能发挥磷酸钙的骨传导能力，又克服了单一陶瓷材料韧性差，不能用于承重部位的缺陷，又能延缓单纯镁支架降解过快的问题[12]。同样，将高分子和陶瓷材料复合制备多孔支架，有利于提高支架的机械性能，增强生物活性并减少高分子材料降解造成的副反应[13-14]。

随着人们对组织工程支架材料研究的深入，发现理想的组织工程材料除了提供支撑作用外，还应具备利用自身的表面结构和化学性能为细胞提供力学及生物学信号，达到调控细胞行为的功能。生物材料的表面硬度、微纳米结构、孔径尺寸及化学成分等都决定着材料表面的理化性质，也影响着相关蛋白质的吸附行为[15]，进而影响细胞的免疫调节能力及成骨能力[16]。清华大学的崔福斋组通过自组装制备了与天然骨成分及纳米结构相似的纳米晶羟基磷灰石/胶原的骨修复产品“骼金”[17]，获得美国食品和药品管理局认证并应用于临床，效果良好。因此，通过改变支架材料的表面特性来调节细胞生长行为，开发具有细胞响应功能的支架材料将是骨组织工程学研究的主要方向。

2　骨组织工程种子细胞的研究

生物支架只有在种植特定种子细胞且细胞在支架上正常生长和发挥其生物学功能，才能完成真正意义上的组织工程构建。要获取合适的种子细胞应用于临床，需满足以下要求：①具有良好的扩增能力和成骨分化潜能。②植入体内不引起免疫反应和致瘤。目前，临床上广泛使用的自体种子细胞主要是经病人髂骨穿刺，从骨髓中分离提取出来的骨髓间充质干细胞(BMSCs)，具有良好的成骨分化潜能，移植后生物安全性高，被认为是最有潜力的种子细胞。但缺点在于BMSCs的获取会造成供区损伤，且骨髓中含量稀少。其体外增殖能力有限，扩增能力会随患者年龄增加而降低。因此，国内外学者对别的干细胞进行了大量研究，试图寻找更为合适的种子细胞。胚胎干细胞属于全能干细胞，具有多向分化潜能和无限增殖的能力，理论上是用于骨组织工程种子细胞的最佳选择。而胚胎干细胞面临的伦理学争论和异体排斥反应的障碍，使其来源与临床应用受到极大限制。此外，近年从骨外组织中如脂肪、皮肤和外周血等组织中分离出的MSCs，在诱导因子作用下能定向分化为成骨细胞[18-19]。与BMSCs相比，这些骨外组织中的干细胞获取更为容易且对供体造成损伤更小。但它们均为成体干细胞，不具备无限增殖及分化潜能，仍存在扩增能力随年龄增加而降低的问题。且此类研究尚在起步阶段，其成骨效果和机制还有待进一步研究。

鉴于种子细胞增殖能力和免疫原性无法协调统一的问题，人们通过基因技术改变细胞性能使其达到两者的统一。Takahashi等于2006年首次报道利用病毒载体将四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc)导入小鼠成纤维细胞中，获得类似胚胎干细胞样，具有全能分化潜能的诱导多能干细胞(iPSCs)，并在人的体细胞中获得成功[20]。这种方法既增强了自体细胞的增殖分化潜能，又解决了异体排斥反应的问题，这预示着iPSCs应用于骨组织工程的巨大潜能。但此方法涉及逆转录病毒的使用以及原癌基因c-Myc和Klf4的使用，存在致瘤的风险。因此，研究者从载体类型和重编程因子的筛选等方面进行大量研究，以此来降低致瘤可能性，并取得了可喜的成果[21-22]。另外，针对异体细胞，研究者通过基因技术修饰种子细胞，阻断机体识别信号或使T细胞无法识别从而产生免疫耐受[23]，让种子细胞能在体外大量增殖又不具备免疫原性，以达到异体移植的目的。

此外，干细胞来源的种子细胞用于构建骨组织工程过程中，为了维持干细胞诱导分化后种子细胞特性，一般需要持续给予诱导分化因子(如骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子等)的刺激。为了实现诱导因子的持续表达，目前的研究将诱导因子相关基因通过转染的方式导入细胞内部，通过细胞增殖的方式实现成骨相关基因的长期表达，从而达到促进成骨的目的[24]，但应用于临床还需考虑转染载体的安全性及转染基因表达效率等问题。

3　骨组织工程构建技术研究

在制备支架材料与获取种子细胞后，如何高效复合构建组织工程骨是骨组织工程应用于临床必需解决的问题。目前的构建策略主要有两种：①体内组织工程技术：即视体内自然生理环境为生物反应器，将携载生长因子或复合细胞的多孔支架直接植入体内，在体构建组织工程骨或进行骨缺损原位修复。②体外组织工程技术：利用体外细胞培养技术，将复合生长因子和种子细胞的多孔支架在体外培育，形成工程化骨组织，然后植入体内进行骨组织修复。

对体外组织工程构建而言，以往的研究常将种子细胞直接滴在支架上，进行静态培养。此方法仅靠支架孔隙的物理作用将细胞截留在支架上。由于重力作用，细胞往往沉积在支架底部，支架内部或顶部缺乏足够细胞，且营养代谢受限。结果导致细胞接种率低，体外培育周期长，难以做到组织工程骨规模化生产。因此，为了模拟组织生长体内微环境，人们开发了动态培养系统，即生物反应器。它能提供体内组织生长所需的动态环境，给予细胞应力刺激，增强支架材料内细胞之间的空间接触，同时加强支架内部营养物质的传输及代谢。特别是流动灌注生物反应器的应用，能够实现在体外直接培育大块组织工程骨[25]。这预示着生物反应器在组织构建过程中良好的应用前景，但要模拟体内生理环境，其他控制条件还需进一步研究改善。此外，为了建立组织工程骨培育过程中的血液供应，构建过程往往与血管内皮等细胞联合培养或采用显微外科手段辅助[26]。组织工程能否成功构建是组织工程骨应用于临床的关键环节。

4　骨组织工程临床应用研究

骨组织工程构建的最终目的是应用于临床实现骨缺损修复。因此，国内外学者在进行骨组织工程基础研究的同时，也开展了组织工程骨的临床应用研究。华西医院生物治疗国家重点实验室项舟团队将成骨细胞与生物衍生骨支架材料复合制备的组织工程骨用于修复骨缺损患者52例，并对其中10例进行7年随访，发现组织工程骨植入体内具有良好的成骨能力，长期修复效果良好，未见明显排斥反应及并发症[27]。此外，第三军医大学刘杰等取患者自体BMSCs与同种异体脱钙骨基质复合，构建个体化组织工程骨用于30例长骨缺损患者，随访发现成骨速度与效果均与自体骨相似，具有良好的成骨效能和生物安全性[28]。国外Sándor等将自体脂肪干细胞种植在磷酸三钙支架材料上，并复合骨形态发生蛋白制备组织工程骨用于原位修复患者前下颌骨缺损[29]。10个月后发现组织工程骨在缺损处成骨效果良好，表明其在大段下颌骨缺损修复方面具有良好的应用前景。

5　小结与展望

目前，虽然在骨组织工程的基础研究和临床应用方面取得了一定进展，但要真正实现组织工程骨临床应用及产品的产业化，仍面临诸多困难。首先，关于种子细胞的来源、保存、运输及技术流程等具体事宜还缺乏相关的标准；其次，对组织工程产品临床使用安全性尚无完善的评价方法；此外，支架材料目前在机械性能上还很难完全满足承重部位的力学要求，构建血管神经化组织工程骨还存在较大困难，还有临床上骨缺损处常并发骨感染，而组织工程骨本身并不具备抗感染能力。这些都是骨组织工程从基础研究向临床大规模应用转变需要解决的关键技术问题。总之，骨组织工程的研究应以临床应用和市场产业化为指导进行相关基础研究。我们坚信，通过广大研究者的共同努力，必将涌现出造福骨缺损患者的组织工程骨产品，真正体现出骨组织工程重大的社会意义和经济价值。

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Research status and clinical application of bone tissue engineering

FENG Gang,XIAO Dongqin

(ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCells,TheSecondClinicalInstituteofNorthSichuanMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

Bone tissue engineering has made significant progress in the basic research since the concept of tissue engineering was proposed in the 1980s. However, there are still many difficulties and challenges in large-scale clinical application for bone tissue engineering. In this paper, a comment on basic status and clinical application was elaborated from the four aspects of scaffold materials, seeded cells, tissue construct and preliminary clinical application, respectively. It is expected that the advancement of bone tissue engineering would promote the clinical application of tissue-engineered bone and benefit patients.

Bone tissue engineering; Scaffold; Seed cells; Clinical application

国家自然科学基金(81171472、81201407)；四川省科技厅应用基础项目(2016JY0123)；四川省教育厅创新团队资助项目(13TD0030)；四川教育厅重大培育项目(15CZ0021)

R 318.08

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.002

2016-04-01； 编辑： 张文秀)