七彩神仙鱼和神仙鱼的DNA条形码研究

陈信忠袁芳许奕宸郭书林龚艳清杨俊萍

（1.厦门出入境检验检疫局福建厦门361026；2.集美大学水产学院）

七彩神仙鱼和神仙鱼的DNA条形码研究

陈信忠1袁芳2许奕宸2郭书林1龚艳清1杨俊萍1

（1.厦门出入境检验检疫局福建厦门361026；2.集美大学水产学院）

应用通用引物测定了观赏鱼市场上具有较高价值的7个品系七彩神仙鱼和3个品系神仙鱼的16S rRNA基因和CO I基因部分序列，并应用DNA序列分析软件，对这些基因进行了同源性比较和系统发育分析。通过GenBank中的核酸BLAST和BOLD SYSTEMS数据库对这些基因序列进行比对，结果表明16S rRNA基因和CO I基因可以在物种水平对神仙鱼进行准确鉴定，但对七彩神仙鱼只能进行有限度的鉴别。由于不同品系的七彩神仙鱼或神仙鱼，尽管其体色和斑纹具有明显差异，但16S rRNA基因和CO I基因序列高度相似。因此，对这些观赏鱼依靠16S rRNA基因或CO I基因都无法准确鉴定，需要研究进化速度更快的DNA基因条码。

基因条码；七彩神仙鱼；神仙鱼；物种鉴定；16S rRNA；CO I

1 前言

观赏鱼是近年来全球蓬勃兴起和快速发展的产业，2013年我国观赏鱼的规模已发展到36.9亿尾[1]，成为发展潜力最大的新兴产业之一。七彩神仙鱼（Symphysodon sp）和神仙鱼（Pterophyllum sp）是观赏鱼市场上最常见的两种慈鲷，因其色彩斑斓、体态飘逸优雅而深受观赏鱼爱好者的喜爱。神仙鱼又称天使鱼，原产于南美洲亚马逊水域及其支流，已知的野生种类有大神仙鱼（P.scalare）、埃及神仙鱼（P.altum）和利氏神仙鱼（P.leopordi）。七彩神仙鱼又称盘丽鱼，原产于巴西、哥伦比亚和委内瑞拉的热带雨林河流中，已知的野生种类有黑格尔七彩神仙鱼（S.discus）、野生棕七彩神仙鱼（S.aequifasciatus）和野生蓝七彩神仙鱼（S.haraldi）；人工繁育的七彩神仙鱼主要有蛇纹七彩、全色蓝七彩、红点绿七彩、鸽子红七彩、全色红七彩、条纹松石七彩和黄金七彩等品系，不同品系七彩神仙鱼的区别主要表现在鱼身的花纹和色彩方面，鱼体的形态基本相似[2]。神仙鱼和七彩神仙鱼经过长期的人工选育、杂交等改良，已培育了许多绚丽多彩的品系，目前水族馆中的神仙鱼和七彩神仙鱼大多为人工繁育的品系，因其色彩和斑纹具有明显差异，欣赏价值和经济价值也有巨大差别。而不同品系的观赏鱼幼体阶段很难依据形态进行鉴别，因此，需要建立其他准确快速的鉴别方法。

由于形态学分类方法的局限性，近年来越来越多的分子生物学方法被应用到鱼类物种鉴定中，其中应用最广泛的DNA条形码技术不仅可以鉴定已知物种，而且可以发现传统分类学方法无法鉴定的新物种和隐存种。该技术由Hebert等于2003年首次提出，主要利用一段短的DNA序列来实现快速、准确和自动化的物种鉴定标记[3，4]。2004年鱼类生命条形码计划（Fish Barcode of Life，FISH-BOL）启动，建立了鱼类DNA条形码数据库，重点收集15000种海水鱼类的DNA条形码。随后的研究中，CO I基因和16S rRNA基因被证明是物种鉴别较为理想的基因条码，被广泛应用于海洋鱼类的鉴定。2009年1月，国际生命条形码计划（International Barcode of Life，IBOL）启动，建立了生命条形码数据库系统（Barcode of Life Data Systems，BOLD）。随后建立了“海洋生物条形码组织”（Marine barcode of life，MarBOL），收录了6199个海洋物种的37182个条形码信息[5]。由于绝大多数观赏鱼野生物种均来自非洲三大湖和南美洲亚马逊河流域，对这些物种的基因条码研究报告很少，有关神仙鱼和七彩神仙鱼的基因条码研究也很少。程磊等（2012）研究了鲫属（Carassius）某些种和亚种中的CO I基因变异，发现欧亚大陆与日本列岛的鲫鱼（C.auratus）有明显分化，银鲫（C.auratus gibelio）应被视为鲫的一个亚种，而不是一个有效物种[6]。王茜等（2014）报告了天津地区养殖的4种鲤科鱼类的CO I基因部分序列，认为CO I基因不但可以作为物种辨识的良好DNA条码，而且在鲤科鱼类的种间系统发生方面也具有一定的适用性[7]。本文对观赏鱼市场上常见的两种10个品系的观赏鱼进行研究，以探讨基因条码在这些观赏鱼品种鉴别中的应用价值。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验样品

实验所用的神仙鱼和七彩神仙鱼均购自厦门市水族馆，其中神仙鱼包括黑神仙鱼、金头神仙鱼和熊猫神仙鱼等3个品系，七彩神仙鱼包括全色红七彩神仙鱼、红松石七彩神仙鱼、蓝松石七彩神仙鱼、全色蓝七彩神仙鱼、黄金七彩神仙鱼、红点黄金七彩神仙鱼和天子蓝七彩神仙鱼等7个品系。每一个品系选择具有相同形态、体色和斑纹的10条鱼进行实验。

2.1.2 仪器

Veriti PCR仪：美国ABI公司；台式冷冻离心机：美国Thermo公司；FlashGel闪胶系统：Lonza公司。

2.1.3 试剂

动物组织基因组提取试剂盒：Tiangen公司。

2.2 方法

2.2.1 DNA提取

用洁净解剖刀和剪刀取鱼体背部肌肉约100 mg，按照试剂盒方法提取DNA；提取的DNA置于-20℃冰箱保存备用；取完样的鱼样品置于-70℃超低温冰箱中保存。

2.2.2 PCR引物

扩增观赏鱼16S rRNA的引物参考Palumbi（1996）报告的方法[8]，上游引物序列为16Sar-5：5’-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3’，下游引物序列为16Sbr-3：5’-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3’，扩增片段长约590 bp；扩增CO I的引物参考Ivanova（2007）报告的方法[9]，上游引物序列为FF2d：5’-TTC TCC ACC AAC CAC AAR GAY ATY GG-3’，下游引物序列为FR1d：5’-CAC CTC AGG GTG TCC GAA RAA YCA RAA-3’，扩增片段长约680 bp。

2.2.3 PCR扩增

采用50 μL反应体系，即在PCR反应管中加入17.5 μL超纯水，5 μL模板DNA，25 μL2×Taq PCR MasterMix（包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂），引物（20 μmol/L）各1.25 μL。反应程序为：先95℃预变性1 min，然后95℃15 s、52℃（扩增CO I基因）或54℃（扩增16S rRNA基因）15 s、72℃30 s共35个循环，最后72℃延伸7 min，4℃保存。

2.2.4 电泳

为确认扩增效果，将扩增的产物进行电泳。采用LONZA闪胶系统（FlashGelTMDNA System），在预制好的含有缓冲液的琼脂凝胶，加入样品和标记（Marker），观察结果。

2.2.5 PCR扩增产物的序列测定

扩增产物纯化后送上海美吉生物医药科技有限公司测序。

2.2.6 DNA序列分析

利用chromas软件和CLUSTAL X软件对CO I基因和16S rRNA基因测序结果进行拼接和分析。应用MEGA软件[10]，选择Kimura-2参数模型制作系统发育树，计算遗传距离。系统分析采用邻接法（neighbor-joining，NJ），发育树采用重复抽样分析（Bootstrap）1000次检验各分枝的置信度。

2.2.7 数据库比对

将测序所得到的16S rRNA基因和CO I基因序列在GenBank和BOLD SYSTEMS数据库中搜索相似序列，进行鉴定结果分析。

3 结果

3.116 S rRNA基因和CO I基因检测结果

神仙鱼和七彩神仙鱼的16S rRNA基因和CO I基因检测结果表明，上述两对引物均能很好地扩增相应的基因片段。3个品系神仙鱼的组内序列基本一致，差异不超过1个碱基。在7个品系的七彩神仙鱼中，全色蓝七彩和全色红七彩的品系内基因序列完全一致；红松石七彩神仙鱼、蓝松石七彩神仙鱼、黄金七彩神仙鱼和红点黄金七彩神仙鱼的品系内序列基本一致，有1-2个碱基的差异；而天子蓝七彩神仙鱼的序列存在较大的组内变异，存在3-4个碱基的差异。

上述神仙鱼和七彩神仙鱼的16S rRNA和CO I基因序列已登录GenBank，其登录号见表1。

表1 神仙鱼和七彩神仙基因GenBank登录号

3.216 S rRNA基因的同源性分析

3.2.1 神仙鱼16S rRNA基因的同源性分析

3个品系神仙鱼的16S rRNA序列与大神仙鱼（KP987118.1）完全相同，与埃及神仙鱼（KT180164.1）的同源性为96.63%。因此，可以确认这3个品系的神仙鱼均来自大神仙鱼，但依据16S rRNA序列显然无法区分不同品系的神仙鱼。

3.2.2 七彩神仙鱼16S rRNA基因的同源性分析

7个品系七彩神仙鱼16S rRNA序列的系统发育树如图1所示。全色红七彩神仙鱼、红松石七彩神仙鱼和天子蓝七彩神仙鱼的16S rRNA序列与Genbank中的S.haraldi（NC_027965.1）完全相同而聚成一支；蓝松石七彩神仙鱼、黄金七彩神仙鱼、红点黄金七彩神仙鱼的16S rRNA序列完全相同，聚成另一支，该序列与S.haraldi（NC_027965.1）的同源性为99.10%；全色蓝神仙鱼单独成为一支，与3种野生七彩神仙鱼均有一定的距离。

图1 基于16S rRNA基因序列的七彩神仙鱼系统发育树

7个品系的七彩神仙鱼与3种野生七彩神仙鱼基于16S rRNA序列的遗传距离见表2，所有七彩神仙鱼之间的遗传距离均小于0.010。因此，依据16S rRNA序列显然难以判定这些品系的来源，也无法区分不同品系的七彩神仙鱼。

表2 七彩神仙鱼基于16S rRNA基因的遗传距离

3.3 CO I基因的同源性分析

3.3.1 神仙鱼CO I基因同源性分析

神仙鱼基于CO I基因的系统发育树见图2。黑神仙鱼和金头神仙鱼最接近，两者仅有1个碱基的差异，与熊猫神仙鱼的差异也很小。3个品系的神仙鱼与大神仙鱼聚成一支，与埃及神仙鱼相距较远。3个品系的神仙鱼与大神仙鱼和埃及神仙鱼基于16S rRNA序列的遗传距离见表3。从表3可以看出，3个品系的神仙鱼均来自大神仙鱼，其中熊猫神仙进化速度更快。表明通过CO I基因条码可以对上述3个品系的神仙鱼进行有限区分，但因为差异较小，难以进行准确鉴别。

图2 基于CO I基因序列的神仙鱼系统发育树

表3 神仙鱼基于CO I基因的遗传距离

3.3.2 七彩神仙鱼的CO I基因同源性分析

七彩神仙鱼基于CO I基因的系统发育树见图3。蓝松石七彩神仙鱼、红松石七彩神仙鱼、红点黄金七彩神仙鱼、黄金七彩神仙鱼等4个品系的CO I基因序列完全相同；全色蓝七彩神仙鱼和天子蓝七彩神仙鱼的CO I基因序列完全相同；全色红七彩神仙鱼与其他品系的CO I基因序列都存在差异。表明人工繁育的七彩神仙鱼与野生种类相比，其CO I基因已经出现一定的进化，而且不同品系的进化速度明显不同。

图3 基于CO I基因序列的七彩神仙鱼系统发育树

表4为七彩神仙鱼与3种野生七彩神仙鱼基于CO I基因的遗传距离分析。表4显示，全色蓝七彩和天子蓝七彩与3种野生七彩神仙鱼的遗传距离最大，分别达到0.020、0.020和0.019，与其他品系的七彩神仙鱼的遗传距离也达到0.017；全色红七彩神仙鱼与S.haraldi、S.discus的遗传距离最小，只有0.003；蓝松石七彩神仙鱼等4个品系的七彩神仙鱼与其他七彩神仙鱼均有一定的遗传距离。因此，通过CO I基因序列分析，可以对人工繁育的不同品系的七彩神仙鱼进行有限的区分，尚无法对所有品系进行鉴别。

表4 七彩神仙鱼基于CO I基因的遗传距离

3.4 在GenBank和BOLDSystem数据库中的搜索结果

神仙鱼和七彩神仙鱼的16S rRNA和CO I基因在GenBank和BOLDSystem数据库中的搜索结果见表5。3个品系的神仙鱼均可以确定为大神仙鱼，两个数据库的搜索结果基本相同。7个品系的七彩神仙鱼在BOLDSystem数据库中的搜索结果排在第一位的均为黑格尔七彩神仙鱼，而且相似度均达到100%，但与其他两种野生七彩神仙鱼的同源性也大于98%；而在GenBank的搜索结果，所有7个品系的七彩神仙鱼的16S rRNA和CO I基因与3种野生七彩神仙鱼的同源性均大于98%。因此，无法根据16S rRNA或CO I基因条码对七彩神仙鱼进行准确鉴定。

表5 16S rRNA基因和CO I基因与数据库相关序列比对结果

4 讨论

4.1 神仙鱼和七彩神仙鱼DNA条形码测定的有效性

Hebert等（2003）通过对13320个物种进行遗传距离统计分析，发现大部分物种的种内遗传距离小于2%，一般都小于1%[3]。因此认为CO I基因可以有效地进行物种鉴定的关键在于物种间的遗传距离大于种内遗传距离，即物种的种内CO I序列的遗传距离一般小于1%，而种间遗传距离通常大于2%。由于鱼类属于比较低等的脊椎动物，常常因为生境不同造成的地理隔离形成很多形态表观特征具有明显不同的种类，依据形态学的分类方法存在大量的同物异名、一种多名现象，但这些鱼类在人工条件下往往可以进行杂交繁育下一代。因此，虽然很多观赏鱼经过人类不断的培育和改良，形成了大量体态、体色、斑纹等完全不同的品系，但这种遗传相对不够稳定，容易受环境和饵料等因素的影响，需要经过几十代或者更多的繁育才可能形成相对稳定的色彩和斑纹，而且这些观赏鱼的种内遗传距离均很小。如人工繁育七彩神仙鱼的色彩和斑纹主要由其父母代的遗传特性所决定，不同七彩神仙鱼的色彩和斑纹特质可以遗传，但要获得纯系的品系，就必须通过该品系的兄弟姐妹之间进行繁殖。

本研究结果也表明，不同品系的神仙鱼或七彩神仙鱼的CO I基因序列，其种内遗传距离均小于2%，因此均未形成独立的物种，这与传统分类学方法得到的结论一致。

4.2 DNA条形码在观赏鱼种类鉴定中的局限性

DNA条形码技术在鱼类鉴定中取得了较好的结果，但该技术在应用于杂交种、近期分化种、混合种、进化速率较低的物种等特殊群体时还存在诸多问题[5]，实际上DNA条形码能否适用于近缘和近期分化的物种确实存在很大争议[11]。由于很多高价值的观赏鱼都是经过杂交、选育等人工干涉以后培育的杂交种，这些品种的CO I基因序列差异都比较小。而且，这些观赏鱼的遗传特性尚不稳定，表现在基因序列会出现一定的变异。本次实验中的多个品系神仙鱼或七彩神仙鱼均存在品系内的碱基差异，有些品系的碱基差异还比较大。因此，用CO I基因作为DNA条形码应用到神仙鱼和七彩神仙鱼等观赏鱼的鉴定中存在明显的不足，尤其在鉴定七彩神仙鱼时，很难做出准确的鉴定结果。这也从另一方面证明目前七彩神仙鱼依据形态学进行分类的结果可能不准确。现有的黑格尔七彩神仙鱼、野生棕七彩神仙鱼和野生蓝七彩神仙鱼等3种七彩神仙鱼可能尚未分化到物种水平，应该都属于同一个物种。实际上，这些七彩神仙鱼在人工条件下常常可以进行杂交繁育子代，也证明其尚未进化到独立的物种。

DNA条形码技术尚处于快速发展阶段，目前的研究基本上限于物种水平，所研究的基因还很有限。BOLDSystem数据库中的物种基本上都限于自然野生的物种，目前只有CO I基因的数据，而CO I条形码序列对种以下阶元的物种鉴定存在明显的局限性。由于CO I基因的突变速率相对线粒体DNA控制区的要慢[11]，因此若针对分化程度低的物种，选择Cytb基因或控制区基因可能更为有效[12]。故对于神仙鱼和七彩神仙鱼等人工干涉较多的物种，应该研究进化速度更快的基因，如线粒体控制区的基因作为DNA条形码。

5 结论

对7个品系七彩神仙鱼和3个品系神仙鱼的16S rRNA基因和CO I基因的研究结果表明，虽然不同品系的七彩神仙鱼或神仙鱼的体色、斑纹等具有明显的差异，但其16S rRNA基因和CO I基因序列高度相似而难以有效鉴别，需要研究进化速度更快的基因。

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Study on the DNA Barcode of the Discuses and Angelfish

CHEN Xinzhong1，YUAN Fang2，XU Yichen2，GUO Shulin1，GONG Yanqing1，YANG Junping1
（1.Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，Fujian，361026；
2.Fisheries College of Jimei University）

The discuses（Symphysodon sp）and angelfish（Pterophyllum sp）were ornamental fishes which had high economic value.Partial sequence of 16S rRNA gene and mitochondrial cytochrome oxidase subunit I（CO I）gene from 7 lines of discuses and 3 of angelfish which had higher value in the market had been amplified using universal primers.The homology and phylogenetic analysis of these genes were carried out by using DNA sequence analysis software.The gene sequence had been compared with the database of GenBank and BOLD SYSTEMS.The phylogenetic tree had been established based on the 16S rRNA gene and the CO I gene.Sequence analysis showed that the 16S rRNA and CO I genes can be used to identify the angelfish accurately in specie level，but it had only limited function in discrimination for discuses.Because of the high similarity of sequences between the different lines of discuses or angelfish，although it had obvious difference in body color and stripes，it is difficult to identify these fishes based on the 16S rRNA or CO I gene.The DNA barcode which had higher rate of evolution should be studied.

Gene Barcode；Discuses；Angelfish；Species Identification；16S rRNA；CO I

Q179；Q523.8

E-mail：chenxz@xmciq.gov.cn

福建省海洋经济发展专项（2015N0015）

2016-10-26