顶空气相色谱法测定黄芪提取物中大孔树脂有机溶剂残留

蔡振华 金松子 蒋庆峰

[摘 要] 目的：建立黄芪提取物中8种大孔树脂有机溶剂残留物和乙醇溶剂残留物测定方法。方法：采用DM-624毛细管气相色谱柱，二甲基甲酰胺-水溶液为溶解介质，氮气为载气，检测器为氢火焰离子化检测器（FID）。测定黄芪提取物中乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷9种有机溶剂残留量。结果：9种有机溶剂完全分离，精密度RSD均小于7.4%，峰面积与浓度均呈良好的线性关系，9种溶剂的平均回收率为84.6%～106.5%，其RSD<6.0%。结论：本方法简便、准确、重线性好，适用于使用大孔树脂后黄芪提取物中苯系列残留物检测。

[关键词] 黄芪提取物；顶空气相色谱法；大孔树脂；残留溶剂

中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2016）01-081-04

本品为黄芪提取物，属于环黄芪醇（CycLoastra-genoL）类化合物，是豆科黄芪属植物中指标性成分类群，是常用中药黄芪中主要生物活性成分，具有调节免疫、强心、抗心脑缺血损伤、保肝、抗炎、抗病毒以及改善肾脏、胰岛损伤等诸多药理作用。

在提取制备工艺过程中使用了大孔吸附树脂。近年来，大孔吸附树脂已广泛用于中药活性成分（如皂苷、总黄酮、内酯、生物碱等大分子化合物）提取分离与纯化，但大孔树脂制造过程中，会带来少量苯、二甲苯、苯乙烯等有害成分，从而造成被提取、纯化出来提取物中含有害物质残留风险[1-2]。

根据中国药典[3]和ICH（人用药品注册技术规范国际协调会）药品中有机溶剂残留量测定指导原则，有必要对大孔树脂有机残留建立检测方法，对其残留量加以控制。目前有关大孔树脂有机溶剂残留测定方法[4-7]及醇类测定方法[8-9]多数采用顶空气相色谱法，也有采用直接进样气相色谱法[10]。本实验建立了顶空气相色谱法测定黄芪提取物中大孔树脂有机溶剂残留物以及测定提取过程中使用到乙醇残留物方法。

1 仪器与试剂

HP 6890N 气相色谱仪，Agilent 7694E 顶空进样器，氢火焰离子化检测器（FID），DM -624 毛细管柱（30.0m×0.53mm×3.00?m） （6%-氰丙基苯-94%-二甲基硅氧烷共聚物），试剂：无水乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷、N，N-二甲基甲酰胺（均为分析纯）、蒸馏水。黄芪提取物样品（批号：20120902、20121215、20121216、20121217 ）由天津药物研究院提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

柱温采用程序升温：以40℃维持2min，以6℃/min升温速率升温至200℃，维持2min。气化室温度为250℃，载气（氮气）流速为5.0 mL/min，分流比1∶1，氢火焰离子化检测器（FID），检测器温度为250℃。

2.2 顶空条件

顶空平衡温度为100℃，平衡时间30min，进样体积3mL。

2.3 对照品贮备液及对照品溶液配制

取无水乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷，精密称定，加二甲基甲酰胺制成浓度分别为2.5248?g/mL、0.0098?g/mL、

0. 0009?g/mL、0.0104?g/mL、0.0097?g/mL、0.0103?g/mL、

0.0103?g/mL、0.0101?g/mL、0.0097?g/mL溶液，作为混合对照品贮备液；精密量取此液5mL置装有适量二甲基甲酰胺水溶液50mL量瓶中，用二甲基甲酰胺水溶液稀释到刻度，混匀，即得对照品溶液。

稀释剂：二甲基甲酰胺水溶液（DMF：H2O=5：2）。

2.4 专属性

经试验证实，溶剂二甲基甲酰胺水溶液不干扰待测溶剂乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷等色谱峰，样品中其他杂质峰不干扰各待测溶剂峰，说明本法专属性强。见图1。

2.5 精密度测定

取6份对照品溶液2mL分别置10mL顶空瓶中，加盖密封。依次连续进样测定，计算峰面积RSD。结果：乙醇、正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷积分面积（n=6）RSD，分别为1.55%、2.73%、1.00%、2.56%、7.36%、1.97%、2.52%、4.12%、4.17%。

2.6 标准曲线试验

分别移取对照品贮备液0.5、0.8、1.0、1.2、1.5mL置10mL量瓶中，用二甲基甲酰胺水溶液稀释到刻度，混匀，配成不同浓度对照品溶液，分别取不同浓度对照品溶液2mL置10mL顶空瓶中，加盖密封，依次进样测定。以各溶剂峰峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，结果见表1。

2.7 回收率试验

分别精密量取对照品贮备液2.0、2.5、3.0mL到装有适量二甲基甲酰胺水溶液25mL量瓶中，用二甲基甲酰胺水溶液稀释到刻度，摇匀，配成不同浓度对照品溶液（80%、100、120%限度）。

精密称取9份黄芪提取物样品（20120902）1000mg置10mL顶空瓶中，分别加入上述不同浓度对照品溶液2.0mL，加盖密封，摇匀，作为系列回收率测试溶液，每个浓度各3份。另取1000mg黄芪提取物样品（20120902）置10mL顶空瓶中，加二甲基甲酰胺水溶液2.0mL，加盖密封作为样品空白溶液。结果见表2。

2.8 检测限及定量限

取对照品溶液用二甲基甲酰胺水溶液逐步稀释，精密吸取2mL置10mL顶空瓶中，进行测定，确定信噪比约为3时检测量作为检测限，信噪比约为l0时检测量作为定量限。结果见表3。

2.9 样品测定

取20120902、20121215、20121216、20121217四批样品，精密称取1000mg到顶空瓶中，加2mL二甲基甲酰胺水溶液溶解混匀，加盖密封，以外标法进行测定。色谱图见图1。

四批样品中苯、二甲苯、苯乙烯均未检出，乙醇、正己烷、甲苯、二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷含量均符合中国药典2010年版标准。结果见表4。

3 讨论

3.1 溶剂选择

大孔树脂残留物（正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、1，4一二乙基苯、二乙烯基苯、正十二烷）均难溶于水，在有机溶剂中溶解性好。黄芪提取物样品不溶于水，在二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中易溶。根据其性质分别考察了二甲基亚砜、二甲基乙酰胺及二甲基甲酰胺3种溶剂。

试验中发现采用纯有机溶剂会使这些残留物在液-气两相中分配系数K增加，导致检测灵敏度下降。故考虑采用有机溶剂和水混合溶剂。参考有关文献[6-7]，先后摸索了以下几种混合溶剂：二甲基甲酰胺-水溶液，二甲基乙酰胺-水溶液，二甲亚砜-水溶液等系统。但二甲亚砜-水溶液在温度较低时容易凝固，二甲基乙酰胺-水溶液在二乙基苯位置空白有干扰，而二甲基甲酰胺-水溶液对测定无干扰。

接着又考察DMF-水混合溶剂不同比例。在保证黄芪提取物样品全部溶解情况下，二甲基甲酰胺-水最大比例为5：2。故选择二甲基甲酰胺-水（5：2）混合溶液作为溶媒，既保证待测残留物与样品都能溶解，又增大了残留物在顶空气体中浓度，使分析灵敏度提高。

3.2 顶空条件选择

由于本法同时测定9种沸点相差较大残留溶剂，研究中发现顶空温度和顶空加热平衡时间对各溶剂峰峰面积影响较大，因此考察了顶空平衡温度分别为90℃、100℃、110℃及平衡时间分别为20min，30min，40 min时各成分出峰情况，结果表明顶空平衡时间在110℃时各峰响应最大，但样品会产生分解峰干扰残留溶剂测定；顶空平衡30时间 min和40 min时，各峰响应接近，最终确定顶空条件为：平衡温度100℃，平衡时间30 min。

3.3 小结

二甲苯、二乙基苯和二乙烯基苯为多种异构体比例固定混合物， 查阅现有文献发现二甲苯可以检测到对二甲苯和邻二甲苯2个峰，二乙基苯及二乙烯基苯一般只能检测到2个峰，本文采用顶空气相色谱法测定黄芪提取物中大孔树脂有机溶剂残留物，灵敏度很高，在色谱图中二甲苯、二乙基苯和二乙烯基苯分别表现为2个峰、3个峰和4个峰，在计算峰面积时候以峰面积总和作为上述各溶剂峰面积进行计算。

参 考 文 献

[1] 范伟赢，王柏章.大孔吸附树脂分离法对提纯中药有效成分影响因素[J].广东医学院学报，2008，26（5）：544-546.

[2] 周福军，刘振国，单淇，等.顶空气相色谱法测定阿可拉定（IC162）中大孔树脂有机溶剂残留物[J].药物评价研究，2010，33（6）：424-427.

[3] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典[S].二部.中国医药科技出版社，2010，附录Ⅷ P 残留溶剂测定法：61-65.

[4] 刘东，杨敏芝，杜守颖.顶空气相色谱法测定大孔树脂提取物中残留溶剂研究[J].药物分析杂志，2009（11）：1877-1880.

[5] 杨婷婷，金松子，李萍萍，等. 顶空气相色谱法测定YP215中大孔树脂残留溶剂[J].现代仪器，2012（5）： 18-20.

[6] 杨玲， 王英锋， 郭雪清，等. 顶空气相色谱法检测黄芩提取物中D-101大孔树脂有机溶剂残留物[J].药物分析杂志，2008，28（5）：814-816.

[7] 李丽敏，钱大公，王柯，等. 顶空气相色谱法测定三七叶苷中大孔树脂有机溶剂残留物[J].药物分析杂志，2007，27（5）：738-741.

[8] 全红娜，金松子，商国举，等. 顶空气相色谱法测定降胆固醇药YA中残留溶剂量[J].现代仪器与医疗，2015（1）：67-69.

[9] 段续，蔡振华，杨婷婷，等. 顶空气相色谱法测定萜类物质（Y211）中甲醇和石油醚[J].现代仪器与医疗，2013（1）：79-81.

[10] 武晓静，徐慧，庄件兵，赵厚民. 气相色谱法测定甲磺酸胺银杏内酯B中大孔树脂有机溶剂残留[J].化学分析计量，2011，20（1）：51-53.