介入呼吸病学的快速现场评价

冯靖

介入呼吸病学的快速现场评价

冯靖

快速现场评价（ROSE）技术历史悠久，但在过去相当长一段时间内并未得到广泛开展。由于各类介入与微创技术快速崛起，加之快速染色制片技术的进步，ROSE技术的价值与优势变得愈加凸显，正在临床中发挥越来越积极的作用。

1 现代ROSE技术的起源和发展

现代ROSE的系统研究和系统meta分析始于1993年，2005年左右，经气管镜针吸活检（TBNA）、经气管镜细针吸引细胞学检查（FNA）与针吸脱落细胞学检查等介入呼吸病学技术大量开展。这些检查具备良好的敏感性和特异性，不仅广泛用于呼吸系统恶性疾病的诊断，在如结节病、肺结核等良性呼吸系统疾病的诊断中也有较大临床意义。如果通过这些检查能够得到合适的标本，则无需进行如纵隔镜、电视辅助胸腔镜及开胸活检等创伤性较大的检查。但在这些检查中，如何判断是否得到了标本？得到的标本量是否足够和合适？标本如何进一步处理？甚至如何立即获得初步诊断等问题就摆在了介入呼吸病学专家面前。显然，这些实时信息的作用是不可估量的。在实际操作中，如果得到了合适标本，操作即应立即终止，可以节省时间并减少患者创伤和并发症的发生。相反，如果没能得到标本，操作应继续进行并同时改变操作的方式方法。而且，如能立即获得初步诊断，不仅能为临床医师提供重要参考，还可以做进一步操作和适当处理，以帮助进行特殊辅助检查，如电子显微镜、免疫组织化学、染色体荧光原位杂交（FISH）、聚合酶链反应（PCR）及微生物学相关检查，从而使得整个操作近乎完美。正因如此，各种类型的ROSE技术在欧美得以广泛使用。由于ROSE技术（本文中特指呼吸ROSE技术）具有获得结果极快和可重复次数极高的优势，使得其在介入呼吸病学和呼吸危重症的治疗方面具有较大的临床意义。近年来，介入呼吸病学新技术应用于临床。主要包括：经支气管镜超声技术、电子导航超细支气管镜技术、电磁导航支气管镜技术及三维仿真支气管镜技术等，加之肺部外科手术技术的进步以及呼吸危重症治疗中对微生物病原学的急切要求，对ROSE技术提出了许多更高的要求。

2 ROSE技术的分类和临床价值

ROSE工作者可以是有专门经验的病理学专家，也可以是呼吸介入中心的技术人员、护士及实习研究生，甚至是直接参与介入操作的临床医师。呼吸ROSE技术主要包括两大部分：快速现场细胞学评价（C-ROSE）和快速现场微生物学评价（M-ROSE）。这两部分缺一不可，相辅相成，构成了呼吸ROSE技术的完整轮廓。

C-ROSE的主要临床意义包括：（1）指导介入呼吸病学诊断的进度。如指导经气管镜黏膜活检、经气管镜深部肺活检（TBLB）、经气管镜深部刷检、TBNA、FNA、经气管镜支气管肺泡灌洗（BALF）、经皮肺活检、经皮胸膜活检、经胸腔镜胸膜活检，以及其他部位（如皮下或深在部位）针吸脱落细胞学检查。（2）指导介入呼吸病学治疗的进度及判断介入呼吸病学治疗的效果。如指导各类经气管镜消融治疗（高频电刀、氩等离子电凝、冷冻切除、光动力治疗、经气管镜微波治疗及经气管镜激光治疗等）。（3）经气管镜确定肺部肿瘤外科手术切除线。（4）指导中央型肺癌患者的诊断及治疗后随访。

M-ROSE的主要临床意义包括：（1）可以提供部分微生物病原的形态学依据。如念珠菌属的属间鉴别，曲霉菌属的属间鉴别，耶氏肺孢子菌、其他类型真菌、球菌和杆菌的形态学，中性粒细胞球菌和杆菌的细菌吞噬现象。（2）可以有极高的重复检查次数。（3）由于可以提供细胞分类与计数及其比例等细胞学背景，因此可以进行病情的估计和疗效的预判。

3 ROSE技术的基本操作方式

ROSE在实际操作中主要是用普通光学显微镜或荧光显微镜对采集到的标本玻片进行立即观察判读并获得结果。所以，ROSE操作实际上由制片、染色和观察3部分构成。由于对时间的要求严格，ROSE操作的核心是如何提高制片和染色的速度。ROSE快速制片方式主要有：（1）小外检组织块滚片（印片）法。用于多数经气管镜或胸腔镜黏膜活检与肺活检，经皮肺活检或其他经皮检到的组织块，还用于TBNA取到的条形组织块。（2）细胞刷涂抹（刷片）法。用于多数经气管镜刷片或用于其他较黏稠样品。（3）喷片法与喷射推片法。用于多数FNA，也用于经皮细针吸引肺细胞学活检或其他经皮检到的细胞学标本，还用于TBNA得到的条形组织块以外的细胞学标本。（4）液基薄层细胞制片（TCT）法。用于液基标本，如胸水或TBNA、FNA获得的液基标本。（5）微孔滤膜过滤法。也用于液基标本。（6）涂抹法。用于痰液等黏稠的液体标本。

对于做好的ROSE制片，应根据患者实际情况适当采用以下方式进行快速染色：（1）极快速（30 s）改良瑞氏染色（WF染色）：它是在瑞氏染色基础上加以改良所形成的一种极快速染色方式，耗时仅30s，多数情况下1 min内就可以在显微镜下观察。这种染色通用于绝大多数C-ROSE与M-ROSE，简单、快速、直接、有效，是ROSE最常用的染色方式。通常，单做WF ROSE在大多数情况下就已经足够了。而对于不熟悉WFROSE的呼吸介入中心，也可直接采用瑞氏染色或瑞氏-吉姆萨染色，同样能在数分钟内完成。瑞氏和改良瑞氏染色主要由A液浸泡、磷酸盐缓冲液浸泡、B液浸泡和清水清洗4步构成，然后立即用吸水纸吸干，上普通光学显微镜观察。（2）极快速（10 s）改良乳酸染色，也叫改良乳酸酚棉兰染色，这种染色主要应用于各类真菌。（3）快速（30min）支原体DNA霍氏荧光染色，这种染色耗时30 min，主要应用于支原体感染。（4）快速（20min）金-罗耐酸菌荧光染色，也叫金胺O-罗丹明荧光染色，主要应用于抗酸菌如结核分枝杆菌和努卡菌，也用于军团菌。通常结核分枝杆菌和努卡菌为金胺O-罗丹明染色强阳性，而军团菌染色可呈弱阳性。（5）试剂盒化快速（3 min）革兰染色，这种染色主要应用于球菌和杆菌，根据笔者的经验，WF染色完全可以实现革兰染色的功能。

4 现代C-ROSE在临床的应用情况

C-ROSE在介入呼吸病学新技术应用中发挥了不可低估的作用。Loo等将ROSE应用于电磁导航支气管镜（ENB），他将ROSE与正电子发射计算机断层扫描（PET-CT）、ENB钳检和ENB刷检结合起来，用于对约2cm的外周肺结节进行检查，结果显示ROSE可明显提高诊断率，使总体诊断率达94%，且无任何操作相关并发症的产生。在另一些研究中，ROSE技术被应用于ENB和荧光导航支气管镜技术中，也明显提高了诊断率，并减少了操作相关并发症的发生。经支气管镜超声技术也是近几年的一项新兴技术。Collins等将ROSE与该技术联合应用进行TBNA，结果显示同不使用ROSE相比，ROSE可减少33%的无谓穿刺和30%的无谓涂片，有68%的患者由于使用了ROSE技术，使得TBNA一次穿刺即获得成功。最近也出现了一批高科技C-ROSE技术，例如具有“一站式快速诊断”之称的波谱库ROSE技术，可将玻片与波谱库进行快速对比，从而立即获得诊断。这些诊断不仅限于恶性肿瘤，对于良性疾病和微生物病原也有快速诊断能力。也有 C-ROSE工作者将远程实时通讯技术应用于ROSE，使得一些ROSE水平欠发达的中心在介入呼吸病学操作中得到ROSE专家的指导。

5 现代M-ROSE在临床的应用情况

M-ROSE在欧美历史悠久，但真正大规模临床应用是近几年才开始的，尤其是众多呼吸重症监护病房（ICU）建立起来后，如何获得真正的感染致病原是困扰呼吸科与感染科医生的一大问题。痰培养的临床意义日趋受到弱化，呼吸ICU往往需要通过气管镜来采集真正意义上含有感染源的标本。介入呼吸病学采集感染源标本一般通过刷检和BALF两种方式进行。肺活检不像刷检，它可以采集深部肺泡组织及其衬液，对于鉴别定植菌和侵袭性感染菌有一定临床价值。但由于肺活检采集到的标本小，菌落又通常不暴露于组织块表面，需要将标本在培养皿上反复翻滚移动来进行细菌学种植培养。由于苛养菌感染的日趋增加与定植菌的广泛存在严重干扰了细菌培养的可信度，临床医生对于细菌培养越来越不看重。即使细菌培养来自于BALF，临床医生通常也仅仅将其作为参考。M-ROSE的真正优势体现在微生物形态学和中性粒细胞、巨噬细胞或淋巴细胞吞噬细菌这两大方面，更为重要的是，它可以提供明确的细胞学背景。很显然，感染性疾病的细胞学背景如坏死、中性粒细胞与淋巴细胞的大量浸润与非感染性疾病如哮喘的嗜酸性粒细胞为主的细胞学背景存在明显差异，而慢性支气管炎的杯状细胞大量增生提示患者气道的高分泌性。再如，紧密存在的上皮样细胞和部分淋巴细胞提示肉芽肿性疾病的反应性增生，而不提示其他球菌、杆菌和真菌的感染。如果在此基础上，细菌实验室能够提示阳性抗酸染色结果，或者ROSE中金胺O-罗丹明荧光染色阳性，则能够确认结核病的诊断。而对于巨细胞病毒感染，细胞学背景在大多数情况下显得十分明显。当然，如果能将MROSE形态学与其他更先进的微生物学方法如PCR、免疫荧光染色、流式细胞术、基因序列分析等相互结合，则能进一步提高M-ROSE的敏感性与特异性。

在形态学方面，M-ROSE具备天然优势。如果再将TBNA广泛用于感染性疾病，就可以将TBNA 和M-ROSE的作用同时发挥到极致，因为淋巴结尤其是隆突下淋巴结，是肺内各种病原的“天然收集器”。M-ROSE对于真菌（尤其是处于菌丝时相的真菌）的确认相对容易，而且具有极高的灵敏度与特异度。这些容易确认的真菌包括隐球菌、芽生菌、组织胞浆菌、青霉菌和耶氏肺孢子菌，此外对于一些寄生虫如疟原虫、利什曼虫和刚地弓形虫，M-ROSE也能较快得到诊断。结合几种M-ROSE方法，尤其是结合金胺O-罗丹明荧光染色法以后，对于结核也有很高的检出率。中性粒细胞和肺泡巨噬细胞是机体对抗肺部细菌感染的主要防御机制。中性粒细胞、巨噬细胞或淋巴细胞吞噬细菌现象对感染性疾病的微生物病原有明确的提示意义。而当患者罹患血液系统疾病、免疫缺陷性疾病或处于免疫抑制药物治疗中时，吞噬细菌现象将会明显受到抑制。采用BALF快速TCT制片结合WFM-ROSE在中性粒细胞和肺泡巨噬细胞吞噬细菌方面可以获得较高的阳性率。

6 如何开展ROSE工作

尽管ROSE技术有较多优点，但在很多介入中心，该技术尚未得到广泛开展。作为ROSE工作者，应该具备如下能力：（1）要全身心地投入，对ROSE制片要能认、敢认及认对；（2）还要有庞杂的交叉学科知识，ROSE涉及常规呼吸病学、肿瘤学、介入呼吸病学、病理学、细胞学及临床微生物学等多学科的综合知识；（3）分析ROSE结果的时候还要有严密的临床专科逻辑整合能力。应结合病史、查体、影像学、实验室检查等综合分析，做出正确判断。这就决定了呼吸科介入中心医师自己进行ROSE工作不可替代的天然优势。这些医生自己问病史、自己查体、看CT及结合临床检验，再自己取标本，判读ROSE结果的时候，做到一切心中有数，甚至能够预判。ROSE工作者要在长期的ROSE工作中，积累丰富的经验，不断提高临床素养。希望更多的介入中心将更多的时间和精力投入到ROSE中来。

略，读者需要可向编辑部索取)

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.01.002

R56

C

1671-0800(2016)01-0005-03

2015-12-20（本文编辑：陈志翔）

300052天津，天津医科大学总医院

冯靖，主任医师，博士，美国杜克大学博士后，美国国立卫生研究院（NIH）/环境与人类健康科学中心（NIEHS）博士后，斯坦福大学访问学者。主要研究方向：介入呼吸病学和睡眠呼吸障碍，主持国家自然科学基金2项，参加国家自然科学基金2项、国家十五科技攻关课题1项。现任中国睡眠研究会青年委员会副主任委员、中华医学会呼吸病分会组织委员会委员和青年委员、天津市医学会呼吸病学会青年委员会副主任委员、卫生部海峡两岸医药卫生交流协会呼吸专业委员会委员，国家自然科学基金评议专家，国家来华留学生教学专业委员会委员。Email：zyyhxkfj@126.com