肾细胞癌中microRNA相关研究新进展

吕　蔡，张　杰，白志明

(1.中南大学湘雅医学院附属海口医院泌尿外科,海南海口　570208；2.武汉大学人民医院泌尿外科,湖北武汉　430060)



·综述·

肾细胞癌中microRNA相关研究新进展

吕蔡1,2，张杰2，白志明1

(1.中南大学湘雅医学院附属海口医院泌尿外科,海南海口570208；2.武汉大学人民医院泌尿外科,湖北武汉430060)

肾细胞癌(RCC)是成人肾脏最常见的肿瘤，无症状RCC的发病率约占50%，30%的RCC患者就诊时已伴有转移，预后极差，迫切需要发现新的用于RCC诊断和治疗的生物学靶标。微小RNA(microRNA)是一种基因组编码的、内源性的、通过与目标mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)互补结合在转录后水平调节mRNA稳定和翻译的负性调节因子。microRNA在肿瘤形成通路的调节中起重要作用。研究发现microRNA参与RCC的诊断、治疗及预后等多个方面，针对RCC中microRNA调节机制的深入研究有望使RCC的诊断和治疗产生新的变革，实现RCC治疗个体化。

肾细胞癌；微小RNA；诊断；治疗；预后

尽管近年来在肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)的生物学研究、外科治疗和新的靶向治疗应用方面有突破，但RCC患者的预后仍较差[1-2]，伴有转移的RCC患者，其5年生存率仅9%[3]。发现晚、肿瘤异质性、特别是缺乏早期检测、分类和治疗后监测的分子标志物成为RCC治疗的主要障碍[4]。因此，迫切需要发现新的、可作为治疗靶点的生物标志物。随着微小RNA(microRNA，miRNA)的发现，其在生理病理学进程中的功能学研究不断受到重视，近来研究显示miRNA在多种不同肿瘤细胞的转移播散过程中发挥关键性作用[5-6]，可能作为抑癌基因或原癌基因在肿瘤的发生发展中扮演重要角色[7]。本文结合新近国外文献，综述了miRNA在RCC的发病机理、诊断、预后以及治疗等方面相关作用研究进展。

1　microRNA概述

1993年由LEE等[8]首次报道的lin-4基因，随后REINHART等[9]于2000年发现的第二个类似基因Let-7，它们都编码一种长约22个核苷酸小RNA，被命名为微小RNA(microRNA，miRNA/miR)。miRNA是一种基因组编码的、内源性的、通过与目标mRNA的3端非翻译区(3’untranslatedregion, 3’UTR)互补序列结合在转录后水平调节mRNA稳定性和翻译的负性调节因子。当miRNA与靶基因mRNA序列互补配对程度高时，可以使靶基因mRNA在互补区特异性降解；当互补配对程度低时，miRNA则表现为抑制靶基因mRNA的翻译，从而调控基因表达。

miRNA基因定位于蛋白编码或非编码基因的内含子或外显子区域，通过初级miRNA(pri-miRNA)、前体miRNA(pre-miRNA)、双链miRNA片段等不同阶段演变后最终形成成熟的单链miRNA。单链miRNA再进入核蛋白复合体，与其他蛋白质一起，参与组成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，进而发挥调控作用。miRNA是肿瘤生成过程中重要的调节因子。miRNA基因表达的改变与大多数人类恶性肿瘤的发病有关。

2　与肾细胞癌相关的miRNA研究

miRNA在肿瘤形成通路的调节中起重要作用。与正常组织相比，miRNA在肿瘤组织中表达明显异常，可以调节肿瘤形成过程中的重要节点，多项研究比较了RCC与正常肾组织中miRNAs表达谱差异[10-11]。

2.1与RCC病理生理相关的miRNAs透明细胞肾细胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma,ccRCC)中VHL基因是一种抑癌基因，VHL基因的缺失可导致ccRCC的生长。一组40例ccRCC资料显示，与癌旁正常肾组织相比，RCC组织中miR-185表达显著降低，其表达与肿瘤大小、病理分级和TNM分期呈负相关。Luciferase实验发现VEGFA是miR-185直接作用基因，在VHL基因失活的肾癌A498细胞中过表达miR-185可通过下调VEGFA表达抑制肾癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡[12]。研究发现ccRCC组织中miR-335表达水平明显下调，且与患者的淋巴结转移、肿瘤大小、T分期均显著相关。过表达miR-335可抑制肾癌786-O和CaKi-1细胞的增殖和侵袭[13]。miR-29家族(miR-29a/b/c)在ccRCC组织中表达也明显降低，上调miR-29家族表达，可抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭[14]。通过甲基化特异性PCR和亚硫酸氢根基因组序列PCR检测显示ccRCC组织中miR-492表达下调主要是由于其启动子区域CpG岛甲基化引起，抑制了miR-492转录。通过使用DNA去甲基化试剂(5-氮杂-2’-脱氧胞苷)或组蛋白脱乙酰酶抑制剂(4-苯丁酸)，ccRCC细胞中miR-492表达可明显上调，而肾癌细胞的增殖和侵袭活性受到明显抑制，同时还促进了肾癌细胞凋亡和粘附[15]。miR-106a在RCC组织中显著低表达。过表达miR-106a可抑制肾癌细胞的增殖并停滞细胞周期在S/G2期，胰岛素受体底物2(IRS-2)是miR-106a的直接作用基因，miR-106a可通过调控IRS-2同时抑制PI3K/Akt信号通路影响RCC进展[16]。促分裂原活化蛋白激酶8(MAP3K8)在肾癌细胞中高表达，过表达miR-509-3p可抑制MAP3K8在mRNA和蛋白水平的表达，进而抑制肾癌细胞的增殖和迁徙活性[17]。另外miR-510-5p[18]、miR-184[19]、miR-337[20]、miR-1[21]、miR-134[22]等在RCC组织中均呈明显低表达，作为抑癌基因对肾癌细胞的增殖、迁徙和侵袭活性以及细胞周期改变发挥重要作用。

2.2与RCC诊断相关的miRNAs影像学技术的进步和广泛使用使得越来越多的早期RCC被发现，但仍有许多早期RCC难以与肾脏良性病变准确鉴别，可能导致过度的接受肾切除手术，而且RCC患者术后复发的随访也仅仅依赖于影像学检查和临床症状的评估。因此，在血液或尿液中发现新的、具有较高特异性和敏感性、能够早期诊断RCC、早期发现RCC复发及转移的肿瘤标志物十分迫切。qRT-PCR技术有助于发现差异性mRNAs，发现与RCC病理亚型或分期特异性相关的miRNA表达谱。文献报道活细胞可释放miRNA进入体液中，并可被其他细胞所摄取完成细胞间的信号交流。被释放到细胞外的miRNA(细胞外miRs)通常有RNA结合蛋白保护并可嵌入内循环毛细血管中[23]。由于具有相对稳定的性质，细胞外miRNA被认为是可作为诊断、预测疾病的潜在生物学标志物，甚至是可作为靶向治疗的作用靶点。

循环miRNA被认为具有肿瘤检测的临床应用价值，但在RCC早期诊断中的应用未知。WANG等[24]采集了25例RCC和健康对照组患者血清，利用TaqMan低密度阵列分析了754个血清miRNA水平，对于RCC患者血清中明显异常调节的miRNAs，进一步利用qRT-PCR在另一组107例RCC和对照组中进行验证，结果发现RCC患者血清中miR-193a-3p、miR-362和miR-572水平明显升高；而miR-28-5p和miR-378水平则显著降低，即使是T1期患者同样如此。这5种miRNAs组合后的敏感性为80%、特异性为71%。可能这5种血清miRNAs联合检测将有助于临床对早期RCC的辅助诊断。另有报道利用qRT-PCR检测22例RCC患者和27例健康志愿者血浆中循环表皮生长因子/EGFR-MAPK相关的miR-7、miR-221和miR-222表达：结果相比健康人群，RCC患者有较高的循环miR-7表达水平(高6.1倍，P<0.001)，与携带低基因增殖谱RCC患者相比，携带中/高基因增殖谱肾细胞癌患者的疾病进展周期明显缩短，早期复发风险较高，总生存期短；且miR-7、miR-221和miR-222的表达均明显升高[25]。提示中/高基因增殖谱是肾细胞癌的不利预后因素，miR-7、miR-221和miR-222表达可作为EGFR/MAPK信号活化的表型标志物。而有关尿液miRNA作为泌尿系肿瘤生物标志物的进展也已见有报道。MLCOCHOVA等[26]详细分析了尿液miRNA的起源、稳定性、质量控制以及作为泌尿系肿瘤新一类生物标志物的可行性及其特征。

2.3与RCC预后相关的miRNAs通过综合分析RCC全基因组miRNAs表达谱，有望发现具有预后价值的肿瘤特异性miRNA。荟萃研究分析了RCC组织与癌旁组织中差异miRNA表达谱作为RCC预后标志物的意义，共纳入29项研究，结果发现RCC组织中表达上调的miR-21、miR-210以及表达下调达的miR-141、miR-200c和miR-429均与癌特异性生存期(cancerspecificsurvival,CSS)有相关性[27]，认为以这5种miRNAs为基础的分类法可作为RCC(特别是ccRCC)评估CSS的预后预测工具，有助于RCC患者辅导和个体化治疗方案的选择。GE等[28]比较了58对肾癌与癌旁正常组织中miRNA差异表达谱，结果有147个miRNAs表达异常，并进一步在411例ccRCC中检测异常表达的miRNA与预后的相关性，发现22个miRNAs表达与患者生存期明显相关，可作为独立的预后监测参数。相关研究也显示ccRCC组织中miR-497[29]、miR-506[30]和miR-27a-3p[31]的异常表达均可作为肾癌复发及患者总生存率的独立预测因子。

乳头状肾细胞癌(papillaryrenalcellcarcinoma,pRCC)是肾癌第二常见的亚型。为分析miRNAs表达谱与pRCC进展和预后的关系，163例原发性pRCC患者纳入回顾性观察研究，与进展相关的miRNAs表达谱中，26个miRNAs与病理分级有关、28个miRNAs与T分期有关、16个miRNAs与淋巴结转移有关、3个miRNAs与远处转移有关、32个miRNAs与组织学类型有关[32]。其中12个miRNAs(miR-134、miR-379、miR-127、miR-452、miR-199a、miR-200c、miR-141、miR-3074、miR-1468、miR-181c、miR-1180andmiR-34a)与患者的生存期有关，多因素Cox回归分析显示miR-200c、miR-127、miR-34a和miR-181c是pRCC的独立预后因素。靶基因预测显示miR-200c有113个、miR-127有37个、miR-34a有180个靶基因，并包含有15个分子通路。因此特异性miRNA与pRCC的进展和预后有关，miR-200c、miR-127、miR-34a可能是pRCC预后相关因子。

嫌色细胞性肾细胞癌(chromophobecellrenalcellcarcinoma,chRCC)是肾癌中第三常见组织亚型。GE等[33]收集了58例原发性chRCC患者，分析基因组miRNA表达谱，研究miRNA表达与chRCC患者进展和预后的相关性。结果在22例chRCC患者中发现有105个miRNAs在肿瘤与瘤旁组织中有差异表达，其中27个miRNAs与病理T分期有关、9个miRNAs与淋巴结转移有关。而miR-191、miR-19a、miR-210、miR-425与患者无复发生存期和总生存期有显著相关性，且miR-210是无复发生存期的独立预后因子，认为chRCC具有独特miRNA表达谱，且与疾病进展和预后有相关性。

2.4与RCC治疗相关的miRNAsRCC的特点是对化疗不敏感，miRNA的异常表达可能与肿瘤的化疗敏感性有关。PENG等[34]利用qRT-PCR检测了32对ccRCC组织标本(含癌旁正常对照组)，发现肾癌组织中let-7b和let-7c表达明显降低，且let-7b表达与病理分级有关。细胞增殖和克隆形成实验发现：经let-7b或let-7c联合5-FU转染后肾癌786-O细胞增殖活性受到抑制，5-FU抗肿瘤效应被加强。进一步通过luciferase实验显示，let-7b和let-7c可直接结合Akt2的3’UTR。过表达let-7b和let-7c可抑制Akt2表达，而抑制Akt2可通过凋亡通路增强5-FU的抗肿瘤敏感性。因此认为let-7b和let-7c的异常调节可通过下调Akt2增强RCC细胞对5-FU的化疗敏感性。

化疗诱导的自噬活化作用常常与肿瘤化疗抵抗有关。miR-30a可通过下调Beclin-1抑制自噬活性产生。在多种人RCC组织和细胞系中miR-30a表达是明显降低的，同时其作用的Beclin-1基因表达是升高的。索拉菲尼诱导786-O和A498细胞的自噬活性作用可通过检测p62降解、Beclin-1/自噬蛋白5上调和轻链3B-Ⅰ/-Ⅱ转换等现象证实[35]。使786-O或A498细胞过表达miR-30a后可抑制Beclin-1的表达、同时强化了索拉菲尼对肾癌细胞的毒性作用。相反，沉默miR-30a后可使Beclin-1表达上调，并抑制了索拉菲尼的肾癌细胞毒性作用。自噬抑制剂，如氯喹，可增强索拉菲尼的活性，造成大量细胞凋亡。通过siRNA技术敲除Beclin-1或自噬蛋白5也可增加索拉菲尼诱导的肾癌细胞毒性。因此RCC中miR-30a的调节异常可能通过自噬依赖性通路干预索拉菲尼介导凋亡作用的效果。

为制定个体化最佳治疗方案，仍然需要不断探索更好的预测标志物。miRNA能够调节肿瘤细胞的生物学行为，可能成为评价肿瘤预后及预测治疗效果的标志物。

3　小　结

miRNA是内源性非编码小RNA，能够抑制一系列目的基因的表达。研究miRNA在疾病进展中的作用及其相关分子事件以及miRNA作为药物靶点的可能性已经成为热点，以miRNA为基础的治疗能够作为候选新药用于临床仍面临着一系列严格的标准和条件要求[36]。尽管目前RCC的分子发病机制尚不完全明确，但未来5年关于RCC基因和表观遗传的研究数据可能会出现井喷现象，挑战在于如何利用这些数据信息发现可用于RCC诊断及预后的新的标志物， 但是针对RCC中miRNA调节机制的深入研究有望使RCC的诊断和治疗产生新的变革，实现RCC治疗个体化时代。

[1]RAMANR,VAENAD.Immunotherapyinmetastaticrenalcellcarcinoma:Acomprehensivereview[J].BiomedResInt，2015,367354.

[2]SLABYO,REDOVAM,POPRACHA,etal.IdentificationofMicroRNAsassociatedwithearlyrelapseafternephrectomyinrenalcellcarcinomapatients[J].GenesChromosomesCancer，2012,51: 707-716.

[3]LIH,ZHAOJ,ZHANGJW,etal.MicroRNA-217,down-regulatedinclearcellrenalcellcarcinomaandassociatedwithlowersurvival,suppressescellproliferationandmigration[J].Neoplasma，2013，60: 511-515.

[4]LIM,WANGY,SONGY,etal.MicroRNAsinrenalcellcarcinoma:asystematicreviewofclinicalimplications(Review) [J].OncolRep，2015,33(4):1571-1578.

[5]BERTOLIG,CAVAC,CASTIGLIONII.MicroRNAs:NewBiomarkersforDiagnosis,Prognosis,TherapyPredictionandTherapeuticToolsforBreastCancer[J].Theranostics，2015,5(10): 1122-1143.

[6]WANGW,ZHANGE,LINC.MicroRNAsintumorangiogenesis[J].LifeSci，2015,136:28-35.

[7]LIZ,YUX,SHENJ,etal.MicroRNAdysregulationinuvealmelanoma:anewplayerentersthegame[J].Oncotarget,2015,6(7):4562-4568.

[8]LEERC,FEINBAUMRL,AMBROSV.TheC.eleganheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

[9]REINHARTBJ,SLACKFJ,BASSONM,etal.The21-nucleotidelet-7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhabditiselegans[J].Nature，2000,403(6772):901-906.

[10]MAL,QUL.ThefunctionofmicroRNAsinrenaldevelopmentandpathophysiology[J].JGenetGenomics，2013,40(4):143-152.

[11]HEH,WANGL,ZHOUW,etal.MicroRNAexpressionprofilinginclearcellrenalcellcarcinoma:identificationandfunctionalvalidationofkeymiRNAs[J].PLoSOne，2015,4(10):e0125672.

[12]MAX,SHEND,LIH,etal.MicroRNA-185inhibitscellproliferationandinducescellapoptosisbytargetingVEGFAdirectlyinvonHippel-Lindau-inactivatedclearcellrenalcellcarcinoma[J].UrolOncol,2015,33(4):169.e1-11.

[13]WANGK,CHENX,ZHANY,etal.miR-335inhibitstheproliferationandinvasionofclearcellrenalcellcarcinomacellsthroughdirectsuppressionofBCL-W[J].TumourBiol,2015,36(9): 6875-6882.

[14]NISHIKAWAR,CHIYOMARUT,ENOKIDAH,etal.Tumour-suppressivemicroRNA- 29sdirectlyregulateLOXL2expressionandinhibitcancercellmigrationandinvasioninrenalcellcarcinoma[J].FEBSLett,2015,589(16):2136-2145.

[15]WUA,WUK,LIM,etal.UpregulationofmicroRNA-492inducedbyepigeneticdrugtreatmentinhibitsthemalignantphenotypeofclearcellrenalcellcarcinomainvitro[J].MolMedRep,2015,12(1):1413-1420.

[16]MAY,ZHANGH,HEX,etal.miR-106ainhibitstheproliferationofrenalcarcinomacellsbytargetingIRS-2[J].TumourBiol,2015May28. [Epubaheadofprint]

[17]SUZ,CHEND,ZHANGE,etal.MicroRNA-509-3pinhibitscancercellproliferationandmigrationbytargetingthemitogen-activatedproteinkinase8oncogeneinrenalcellcarcinoma[J].MolMedRep,2015,12(1):1535-1543.

[18]CHEND,LIY,YUZ,etal.DownregulatedmicroRNA-510-5pactsasatumorsuppressorinrenalcellcarcinoma[J].MolMedRep,2015,12(2):3061-3066.

[19]SUZ,CHEND,LIY,etal.microRNA-184functionsastumorsuppressorinrenalcellcarcinoma[J].ExpTherMed,2015,9(3):961-966.

[20]WANGR,MAY,YUD,etal.miR-377functionsasatumorsuppressorinhumanclearcellrenalcellcarcinomabytargetingETS1[J].BiomedPharmacother,2015, 70:64-71.

[21]XIAOH，ZENGJ,LIH,etal.MiR-1downregulationcorrelateswithpoorsurvivalinclearcellrenalcellcarcinomawhereitinterfereswithcellcycleregulationandmetastasis[J].Oncotaret,2015,6(15):13201-13215.

[22]LIUY,ZHANGM,QIANJ,etal.miR-134Functionsasatumorsuppressorincellproliferationandepithelial-to-mesenchymaltransitionbytargetingKRASinrenalcellcarciniomacells[J].DNACellBiol,2015,34(6):429-436.

[23]HUANGX,LIANGM,DITTMARR,etal.ExtracellularmicroRNAsinurologicmalignancies:chancesandchallenges[J].IntJMolSci,2013,14(7):14785-14799.

[24]WANGC,HUJ,LUM,etal.ApaneloffiveserummiRNAsasapotentialdiagnostictoolforearly-stagerenalcellcarcinoma[J].SciRep,2015,5:7610.

[25]TEIXEIRAAL,DIASF,FERREIRAM,etal.CombinedInfluenceofEGF+61G>AandTGFB+869T>CfunctionalpolymorphismsinrenalcellcarcinomaProgressionandoverallsurvival:ThelinktoplasmacirculatingMiR-7andMiR-221/222Expression[J].PLoSOne,2015,10(4):e0103258.

[26]MLCOCHOVAH,HEZOVAR,STANIKM,etal.UrinemicroRNAsaspotentialnoninvasivebiomarkersinurologiccancers[J].UrolOncol,2014,32(1):41.e1-9.

[27]TANGK,XUH.Prognosticvalueofmeta-signaturemiRNAsinrenalcellcarcinoma:anintegratedmiRNAexpressionprofilinganalysis[J].SciRep,2015,5:10272.

[28]GEYZ,WUR,XINH,etal.Atumor-specificmicroRNAsignaturepredictssurvivalinclearcellrenalcellcarcinoma[J].JCancerResClinOncol,2015,141 (7):1291-1299.

[29]ZHAOX,ZHAOZ,XUW,etal.Down-regulationofmiR-497isassociatedwithpoorprognosisinrenalcancer[J].IntJClinExpPathol,2015,8(1):758-764.

[30]YANGFQ,ZHANGHM,CHENSJ,etal.MiR-506isdown-regulatedinclearcellrenalcellcarcinomaandinhibitscellgrowthandmetastasisviatargetingFLOT1[J].PLoSOne,2015, 10(3):e0120258.

[31]NAKATAW,UEMURAM,SATOM,etal.ExpressionofmiR-27a-3pisanindependentpredictivefactorforrecurrenceinclearcellrenalcellcarcinoma[J].Oncotarget,2015,6(25): 21645-21654.

[32]GEYZ,XULW,XUZ,etal.ExpressionprofilesandclinicalsignificanceofmicroRNAsinpapillaryrenalcellcarcinoma:Astrobe-compliantobservationalstudy[J].Medicine(Baltimore),2015,94(16):e767.

[33]GEYZ,XINH,LUTZ,etal.MicroRNAexpressionprofilespredictclinicalphenotypesandprognosisinchromophoberenalcellcarcinoma[J].SciRep,2015:10:328.

[34]PENGJ,MOR,MAJ,etal.let-7bandlet-7caredeterminantsofintrinsicchemoresistanceinrenalcellcarcinoma[J].WorldJSurgOncol. 2015,13:175.

[35]ZHENGB,ZHUH,GUD,etal.MiRNA-30a-mediatedautophagyinhibitionsensitizesrenalcellcarcinomacellstosorafenib[J].BiochemBiophysResCommun,2015,459(2):234-239.

[36]CHENY,ZHAOH,TANZ,etal.BottlenecklimitationsformicroRNA-basedtherapeuticsfrombenchtothebedside[J].Pharmazie,2015,70(3):147-154.

(编辑何宏灵)

2015-12-16

2016-05-27

白志明，教授.E-mail：hkbzm@aliyun.com

吕蔡(1979-)，男(汉族)，博士，副主任医师，泌尿系肿瘤基础与临床研究.E-mail：lvcai815@163.com

R737.11

A

10.3969/j.issn.1009-8291.2016.09.022