体外精子发生条件研究进展

孙雯亮，云志中，马玉珍.内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古呼和浩特　000；.内蒙古自治区人民医院泌尿外科，内蒙古呼和浩特　0007；.内蒙古自治区人民医院生殖中心，内蒙古呼和浩特　0007

体外精子发生条件研究进展

孙雯亮1，云志中2，马玉珍3
1.内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古呼和浩特010110；2.内蒙古自治区人民医院泌尿外科，内蒙古呼和浩特010017；3.内蒙古自治区人民医院生殖中心，内蒙古呼和浩特010017

对体外精子发生进行研究，并构建相应的体外诱导环境，实现在体外环境中形成具有正常功能的精子，对于男科医学领域具有重大科研价值和实际应用意义，同时也为生殖科学技术的发展与进步做出贡献。然而在生物体内精子发生所需的条件十分复杂，并且至今对于精子发生的详细机制尚不明确，从而使精子发生过程在体外条件下实现的难度极大。本文主要针对近年体外精子发生条件的研究进展做一综述。

精子发生；体外诱导；培养条件

［Abstract］It has great value in scientific study and clinical practice that we do research in spermatogenesis ex vivo，establish the induction conditions and obtain the functional sperm in vitro，which would make contribution to the improvement of reproductive science.However，the conditions needed for spermatogenesis in vivo are so complicated that the detail mechanism of spermatogenesis has not been defined to date.Consequently，it is highly difficult to achieve spermatogenesis in vitro.In this review，the current state and recent advances in the research of the conditions for spermatogenesis in vitro will be reported.

［Key words］Spermatogenesis；In vitro induction；Culture conditions

在体外培养环境中完成精子发生过程为保存雄性生育力以及治疗雄性不育都指明了新的方向，同时也为在可控的实验条件下探究雄性生殖细胞的详细分化过程提供了新的手段。距离科研人员首次尝试探索精子发生过程并寻求建立体外精子发生的培养环境已有一个世纪，然而只取得了有限的进展。本文主要针对近年体外精子发生条件的研究进展做一综述。

1　通过睾丸组织碎片的体外培养进行体外精子发生

对于雄性生殖细胞的体外培养与诱导分化的首次尝试发生于1915年，Goldschmidt通过对睾丸组织碎片进行体外培养希望能够在体外培养条件下维持完整的精子发生过程。1959年Trowell研发了一种气-液界面器官/组织培养系统，并对成年鼠的睾丸组织进行了培养，在其研究过程中发现了组织培养过程中的一项重要问题，即组织缺氧。1964年Steinberger继承了Trowell团队前期发明的气-液界面培养系统并进行了改进，同时将培养对象改为新生幼鼠的不成熟睾丸组织。在此项研究中发现了保证精子发生顺利进行所需的另一个关键条件，即睾丸微环境的调节作用，同时还发现当向培养液中加入含有维生素A、E、C的血清后精原干细胞才开始分化为初始A型精原细胞。此研究在20世纪60年代进展迅速，这主要归功于A.Steinberger与E.Steinberger两位学者对器官培养系统所做的大量研究，他们选用幼鼠的不成熟睾丸组织成功地将精原细胞诱导分化至减数分裂粗线期。1983年Parvinen证实了Steinberger的研究中精子发生进程停滞在减数分裂粗线期的原因是当时的培养条件所限，但通过利用Steinberger的研究成果Boitani在1993年证实卵泡刺激素在A型精原细胞分化为精母细胞的过程中具有重要作用。而Steinberger的另一项研究开创性的界定了培养液pH介于6.8～7.0的培养条件有利于睾丸组织的体外培养，同时进一步尝试将这种体外培养方法应用与人类的精子发生过程，Steinberge证实利用器官培养法可以将人类的睾丸细胞在体外培养数周，并使精母细胞从细线期分化至粗线期。此后陆续出现关于体外精子发生的报道，但结果都始终无法使精母细胞的分化进程突破粗线期，从而使此项研究的进展停滞数十年。

2010年Gohbara选用出生后4.5～14.5 d的Acr-GFP幼鼠［1］和Gsg2-GFP幼鼠［2］的睾丸，将睾丸切分成组织碎片后放置到分别浸泡在添加了胎牛血清，α-MEM，DMEM，StemPro-34SFM培养液中的琼脂糖凝胶块上进行培养。结果在显微镜下观察到了精子细胞。

2011年Sato等［3-4］取得里程碑意义的突破，Sato团队首先选用出生后0.5～11.5 d的Gsg2-GFP鼠和Acr-GFP鼠睾丸组织。根据标准气-液界面培养法，将睾丸组织碎片放置到浸泡于培养液中的琼脂糖凝胶块上，培养液中添加血清替代物（Knockout serum replacement，KSR），结果KSR使GFP基因的表达程度明显增强，GFP基因持续表达的时间显著延长。通过对减数分裂标志蛋白SYCP1和SYCP3的检测证实所培养的组织中发生了减数分裂，利用HE染色、PAS染色以及免疫荧光染色分别在立体显微镜和荧光显微镜下对所培养的睾丸组织进行组织学检测，结果在7个受检的组织样本中有6个样本中发现了大量精子细胞，另外11个受检样本中有5个样本观察到了生有鞭毛的精子。最后通过圆形精子细胞注射技术（round spermatid injection，ROSI）［5］和胞浆内精子注射技术（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）［6］分别对培养产生出的精子细胞与精子进行了生育能力的检测，结果ROSI组产生出7个健康的子代鼠，ICSI组产生出5个健康的子代鼠。Sato团队选用PCXN-GFP鼠［7］、Acr-GFP鼠、Gsg2-GFP鼠和Sl/Sld鼠这4种鼠的睾丸组织用于体外培养精原干细胞，ICR鼠和W/W v鼠被用作宿主，这两种鼠的睾丸组织作为宿主睾丸接受体外培养出的精原干细胞进行注射移植。选用鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞进行体外培养精原干细胞，随后将体外培养出的精原干细胞经由睾丸网注射入宿主鼠睾丸曲细精管内，随后将宿主鼠睾丸取出，切分为组织碎片后放置到浸泡于培养液中的琼脂糖凝胶块上进行培养，结果发现了精子细胞和精子。最后将培养出的精子细胞和精子通过微受精技术注射到卵母细胞内，结果同样成功产生出健康的后代鼠。

2013年Sato等［8］选用出生后7.5～10.5 d的Acr-GFP幼鼠和Gsg2-GFP幼鼠睾丸组织用于体外培养精原干细胞，W/W v鼠被用作宿主，选用JK1细胞作为饲养层细胞。再次运用2011年研究中的培养方法，结果也成功产生出健康的后代鼠。

2014年Yokonishi等［9］选用雄性Gsg2-GFP鼠和Acr-GFP鼠分别同雌性ICR鼠交配产生子代，将出生后0.5～5 d的子代幼鼠睾丸取出，分别通过缓慢冷冻法或玻璃化冷冻法进行冷冻后放入液氮中保存7～8 d，随后取出解冻，解冻后将睾丸组织放置到浸泡于培养液中的琼脂糖凝胶块上进行培养。结果在30例睾丸组织样本中有17例发现了精子，其中7例样本各含有超过100条精子，6例样本各含有超过10条精子。最后利用微授精技术使培养出的精子细胞与精子产生出了8个健康后代鼠，这些后代鼠之间雌雄交配后证实这8个后代鼠都具有生育能力，并且产生了子代鼠。

在Sato团队之前的研究中开发了一种能使不成熟的幼鼠睾丸组织完成从精原干细胞到精子形成这一完整精子发生过程的体外培养方法［3，4，10］，但对于这种体外培养方法是否也适用于成年鼠的成熟睾丸组织有待证实，于是在2015年Sato等［11］选取成年Acr-GFP鼠、Gsg2-GFP鼠、缺乏维生素A模型鼠和Sl/Sld鼠，将四种成年鼠睾丸切分为组织碎片后放置在琼脂糖凝胶块上，浸泡于添加KSR或AlbuMAX的α-MEM培养液中进行培养。对于Sl/Sld鼠需要在培养液中额外添加鼠干细胞因子Kit配体和集落刺激因子-1。结果在四种成年鼠成熟睾丸组织的培养样本中都发现了精子细胞，但产生出精子细胞的数目较少。从而说明器官培养法能够诱导成年鼠的成熟睾丸组织完成从精原干细胞到精子形成这一完整的精子发生过程，但效率低于对新生鼠不成熟睾丸组织的诱导效率。

2　利用细胞悬液进行体外精子发生

将组织酶解后形成的细胞悬液进行培养，当前现代化的培养条件可提供良好的支持，但仅仅是细胞悬液无法提供精子发生所需的微环境，理想的培养体系中应具有类似生精微环境的培养条件。至今未能在体外条件下实现由人类的精原细胞形成成熟的精子，只有针对精子发生过程中的某一阶段得以实现的报道。Cremades利用人的成纤维细胞作为饲养层将人的圆形精子细胞与成纤维细胞共培养，结果使圆形精子细胞分化为延长型精子细胞。Sousa将人的精原细胞与睾丸支持细胞在添加了卵泡刺激素和睾酮的培养基中共培养，使精原细胞进入了减数分裂。Tanaka将人的精母细胞与成纤维细胞在添加了卵泡刺激素和睾酮的培养基中共培养，使精母细胞分化成为精子细胞。

而对于鼠类的研究中Vigier研究表明当精母细胞与睾丸支持细胞共培养时卵泡刺激素和睾酮会使培养产生的圆形精子细胞数量增加。Iwanami研究发现将幼鼠的A型精原细胞与睾丸支持细胞共培养后可产生圆形精子细胞，但所产生的圆形精子细胞基因型异常，通过微授精注射后没有产生出后代。

3　利用三维培养系统进行体外精子发生

随着对器官培养和细胞培养研究的深入，科研人员发现睾丸细胞在培养环境中的空间条件对精子发生过程也可产生影响，由此产生了三维培养系统。与培养皿中的二维平面培养环境相比，三维培养环境更接近于睾丸内部的立体环境。Lee JH将出生后18 d的鼠生殖细胞与支持细胞、间质细胞置于胶原蛋白凝胶营造的三维培养环境中共培养，结果生殖细胞分化至减数分裂后期并且细胞的存活率良好。Stukenborg利用三维软琼脂培养环境通过添加人绒毛膜促性腺激素和卵泡刺激素使鼠的精原细胞完成了减数分裂并分化形成形态成熟的精子。Abu通过在三维软琼脂培养环境中增添胎牛血清也得到与Stukenborg相同的结果。

对于人类的雄性生殖细胞利用三维培养环境进行体外培养少见报道。Lee D.R的研究中将非梗阻性无精症患者的生殖细胞置于藻酸钙营造的三维培养环境中培养，结果发现了表达有减数分裂后期特异性基因的单倍体生殖细胞，但该细胞未发育为成熟的精子。Lee JH将非梗阻性无精症病人的精母细胞与体细胞放置在由胶原蛋白凝胶营造的三维培养环境中共培养，结果产生出了单倍体精子细胞。

4　在微流体设备中进行体外精子发生

由于在体内睾丸组织周围拥有丰富的毛细血管，毛细血管持续高效地为睾丸组织输送氧气与营养，同时带走睾丸组织的代谢废物，从而维持着睾丸内环境的稳定。而本文之前所述的三种培养方法都缺少与毛细血管类似的微循环系统，从而无法提供像体内一样的培养环境。为克服这一缺陷，研究者们将循环体系引进他们的培养系统中，尤其是Rose团队研发了名为环绕灌注系统的培养体系，在此培养系统中循环流动的培养液快速地从覆盖着透析膜的培养组织表面流过，在此培养系统中多种器官在几个月的培养过程中始终都保持着组织学特征。但是对于在此培养系统中所培养的器官组织的功能没有进行检验与评估。

2016年Komeya等［12］设计了一种微流体设备，利用多孔膜将睾丸组织与持续流动的培养液分隔开，以此模拟体内微血管中的血流与微血管周围组织之间的关系。在这个微流体设备中将出生后0.5～5.5 d的Acr-GFP幼鼠的睾丸组织中的精子发生过程维持了6个月，此过程中产生出的精子细胞和精子通过ROSI和ICSI产生出了健康的后代鼠。同时在利用此微流体设备对睾丸组织进行培养的过程中睾丸组织持续产生出睾酮，并对黄体生成素的刺激作出响应，产生睾酮的能力为每克睾丸组织每日产生睾酮2.4～24.0 μg，这一结果接近于处于体内环境中的睾丸。

这些结果表明这种微流体设备成功的营造出类似于体内的环境，使睾丸组织保持了生理功能和内环境的稳定，因此这种微流体设备为未来多种组织和器官培养条件的改善提供了有价值的基础，并且可能使器官培养方法发生巨大变革。

5　结语

对于体外精子发生的研究至今仍处在有限的实验阶段，对于体外精子发生尚存有众多未被解决的问题：对于精子发生的详细机制还没有明确；在当前的体外诱导条件下精子的产生效率还很低；体外培养所获得的精子生物学活性不高。这些问题都为未来体外精子发生的研究指明了方向。希望随着对体外精子发生研究的不断深入，研究成果能早日应用于临床，从而为辅助生殖提供新的选择。

［1］Li R，Vannitamby A，Zhang J G，et al.Oct4-GFP expression during transformation of gonocytes into spermatogonial stem cells in the perinatal mouse testis［J］.J Pediatr Surg，2015，50（12）：2084-2089.

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［3］Sato T，Katagiri K，Gohbara A，et al.In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes［J］. Nature，2011，471（7339）：504-507.

［4］Sato T，Katagiri K，Yokonishi T，et al.In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines［J］.Nat Commun，2011（2）：472.

［5］Moreira P，Perez-Cerezales S，Laguna R，et al.Transgenic mouse offspring generated by ROSI［J］.J Reprod Dev，2016，62（1）：37-42.

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［10］Yokonishi T，Sato T，Katagiri K，et al.In vitro spermatogenesis using an organ culture technique［J］.Methods Mol Biol，2013（927）：479-488.

［11］Sato T，Katagiri K，Kojima K，et al.In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues［J］.PLoS One，2015，10（6）：e130171.

［12］Komeya M，Kimura H，Nakamura H，et al.Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device［J］.Sci Rep，2016，6：21472.

Advances in the Study of the Conditions for Spermatogenesis in Vitro

SUN Wen-liang1，YUN Zhi-zhong2，MA Yu-zhen3
1.Inner Mongolia Medical University，Hohhot，Inner Mongolia，010110 China；2.Department of Urology，Inner Mongolia People’s Hospital，Hohhot，Inner Mongolia，010017 China；3.Center of Reproduction，Inner Mongolia People’s Hospital，Hohhot，Inner Mongolia，010017 China

R69

A

2096-1782（2016）07-0156-04

10.19368/j.cnki.2096-1782.2016.07.156

孙雯亮（1990.2-），男，黑龙江伊春人，硕士在读，研究方向：泌尿系统疾病及男科疾病。

云志中（1963.9-），男，蒙古族，内蒙古呼和浩特人，本科，主任医师，研究方向：泌尿系统疾病及男科疾病，E-mail：yzzyb168@126.com。