桑葚果酒分批发酵动力学研究

胡永正 李明元 李 梅 丁文武 康 玲 王 冲 陈建桦 李春梅

(西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039)

桑葚果酒分批发酵动力学研究

胡永正 李明元 李 梅 丁文武 康 玲 王 冲 陈建桦 李春梅

(西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039)

以桑葚汁为原料，探讨果酒发酵过程中菌体生长、产物生成和底物消耗变化规律，利用Logistic模型方程拟合菌体生长、产物生成、基质消耗曲线，建立发酵动力学模型。结果表明，当发酵液初始含糖量为200 g/L时，接种5%活化酵母，28 ℃发酵100 h后，残糖含量降为3.86 g/L，酵母数量增长为2.83×108CFU/mL，乙醇含量达到9.01%，菌体生长、产物生成、基质消耗的动力学模型拟合度良好，模型R2分别为0.974，0.988，0.991，模型能较好地反映和预测桑葚果酒发酵变化的过程。

桑葚；果酒；发酵；动力学

桑葚是多年生桑科落叶乔木桑(MorusalbaL.)的成熟果实，桑葚富含糖分、有机酸、游离氨基酸、维生素、花青素、矿物质及微量元素[1]，具有较强的抗氧化活性[2]，已被国家卫生计生委列入“既是食品又是药品的物品名单”[3]，由于其营养丰富且具有一定保健功能，已成为研究热点。目前桑葚已被开发成不同产品，如桑葚汁饮料、桑葚果醋[4]、桑葚酒等[5]。而在桑葚酒的研究中，主要集中于酵母筛选[6]、酿造工艺、物质变化[7]和品质研究[8]等方面，鲜见桑葚果酒酿造动力学模型的相关研究。

发酵过程中环境因素对菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率有极大影响，发酵动力学则是通过菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡探究其内在规律[9]，通过发酵动力学，可以达到对最佳发酵工艺条件的控制，预先估判早期出现的异常情况，同时为分批发酵过渡到连续发酵、发酵放大提供理论依据[10]。

关于模拟发酵过程的模型有多种，GÜLNUR B等[11]总结了发酵动力学中常用的符合菌体生长变化、产物生成变化、底物消耗变化的10余种发酵动力学模型方程，包括Monod方程、Moser方程、Teissier方程等；郑启富等[12]提出一种基于径向基函数网络和最小片而成回归技术的发酵动力学建模方法。另外，Logistic方程是典型“S”型曲线，被广泛地作为发酵过程中酵母的生长变化模型[13]，本试验拟针对桑葚酒酿造过程，通过探究菌体生长数、残糖消耗量、乙醇生成量的变化情况研究桑葚果酒酿造过程中的发酵动力学，建立数学模型并求解相关参数，为桑葚酒酿造过程中的跟踪控制和放大生产提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑葚：大十桑葚，购于四川南部县；

酵母：安琪果酒酵母SY，安琪酵母股份有限公司；

正丁醇：色谱纯，美国sigma公司；

葡萄糖、3-5二硝基水杨酸：分析纯，成都市科隆化工试剂厂；

气相色谱仪：GC2020型，上海析默分析仪器有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-2600型，美国UNICO公司；

血球板计数器：25×16型，上海市求精生化试剂仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

桑葚→榨汁→过滤→添加蔗糖→添加二氧化硫→添加活化后酿酒酵母→恒温发酵→陈酿→澄清→调酒→成品

1.2.2 研究方法 在陈祖满[14]和Wang C Y等[15]对桑葚酒工艺研究的基础上，对桑葚酿造工艺进行预试验后确定最佳工艺，量取250 mL桑葚汁灭菌并调整成分，将活化的酵母按照5%的添加量加入到桑葚汁中，于28 ℃下恒温培养100 h，每隔4 h取样，测定26次取样的样品中酵母数量、残糖含量及乙醇体积分数。

1.2.3 检测方法

(1) 酵母数量：采用血球板计数法。将发酵液稀释一定倍数后用0.1%吕氏碱性美兰染液染色，然后滴于25×16的血球板计数器上，利用16×40倍显微镜进行酵母计数。

(2) 残糖含量：3-5-二硝基水杨酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)比色法。根据王春晓[16]的方法进行简化改进：准确称量干燥至恒重的葡萄糖100 mg定容至100 mL，作为1.0 mg/mL的标注贮备液；取3,5-二硝基水杨酸6.3 g及2 mol/L 氢氧化钠溶液262 mL加到364 g/L的酒石酸钾钠溶液中，再各加5 g结晶酚和5 g亚硫酸氢钠溶解，定容至1 000 mL后贮藏于棕色瓶；标准曲线制作步骤见表1。测定样品时，吸取1.0 mL样品溶液，加入1.0 mL蒸馏水和1.5 mL DNS溶液，混合均匀后沸水中加热5 min后冷却，再加入21.5 mL蒸馏水，摇匀后在540 nm处测定吸光值，根据标准曲线查询样品葡萄糖含量。

表1 葡萄糖标准曲线操作步骤†

† 将各管溶液混合均匀，在沸水中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5 mL蒸馏水，摇匀后，在540 nm处测定吸光值。

样品中糖含量计算：

(1)

式中：

S——样品糖含量；g/L；

m——根据吸光值查找标曲所得糖含量，mg；

v——吸取样品液的体积，mL；

n——稀释倍数。

(3) 乙醇体积分数：气相色谱法。参照GB/T 15038—2006进行改进：以正丁醇作为内标物质，标准样品和待测样品按体积分数2%添加正丁醇作内标。色谱条件：色谱柱：WOD-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升温程序：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min上升至180 ℃，保持1 min，检测器温度250 ℃，18 min；进样器210 ℃，平衡时间3 min；氢气流量：35 mL/min，空气流量：387 mL/min。

1.3 动力学发酵模型

1.3.1 菌体生长动力学模型 前人利用Logistic方程分别对蜂蜜酿酒[17]、甘蔗酿酒[18]进行动力学研究，均得出较好的拟合效果，根据本试验数据统计结果可以看出，菌体数量呈“S”型，因此可将Logistic模型应用于桑葚果酒酿造过程进行拟合。Logistic方程为：

(2)

将该方程左右两边同时积分得：

(3)

式中：

μm1——最大比生长速率，h-1；

xm——最大菌体数量，×108CFU/mL；

x0——初始菌体数，×108CFU/mL；

xt——发酵t时间后菌体数量，×108CFU/mL；

t——发酵时间，h。

1.3.2 产物生成模型 在桑葚果酒发酵初期，由于酵母细胞处于适应阶段，乙醇生成量少，当菌体进入对数生长期后，伴随着菌体大量繁殖，乙醇代谢逐渐旺盛，稳定期的酵母乙醇产量也高，当代谢进入后期，乙醇浓度增加，酵母细胞代谢受抑制，同时糖含量的减少，导致乙醇生成含量减少并趋于稳定，乙醇生成模型同样为“S”曲线，综合考虑，本试验乙醇生成模型仍使用Logistic方程进行模拟预测。Logistic方程：

(4)

将该方程两边同时积分后：

(5)

式中：

μm2——最大乙醇生成速率，h-1；

pm——最大乙醇体积分数，%；

p0——初始乙醇体积分数，%；

pt——发酵t时间后乙醇体积分数，%；

t——发酵时间，h。

1.3.3 底物消耗模型 桑葚果酒酿造过程中，底物中糖主要作用包括：① 作为酵母生长所需碳源，作为结构物质用于合成酵母自身物质；② 被酵母氧化产生能量；③ 生成乙醇；④ 产生改善酒体口感风味物质成分[19]。因此，在菌体生长、产物生成两个模型基础上，结合发酵过程中碳平衡计算，可得糖的消耗公式：

(6)

两边积分后得：

(7)

式中：

s(0)——初始糖含量，g/L；

s(t)——发酵t时间后糖含量，g/L；

x(t)——测定时刻菌体数量，g/L；

x(0)——初始菌体数量，×108CFU/mL；

yx/s——菌体得率系数，×108CFU/g；

p(t)——测定时刻乙醇体积分数，%；

yp/s——产物得率系数，mL/g；

ms——细胞碳源维持系数，h-1；

μm1——菌体最大比生长速率，h-1；

xm——最大菌体数量，×108CFU/mL；

t——发酵时间，h。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

根据体积分数为0%，2%，4%，6%，8%，10%的标准溶液，以正丁醇作内标，以乙醇峰面积与正丁醇峰面积的比值为纵坐标、乙醇体积分数为横坐标作图，见图1(a)，得出标准曲线：y=0.372 6x-0.000 8；根据表1操作，得出葡萄糖标准曲线见图1(b)，回归曲线为：y=0.552 7x-0.012 2。

2.2 桑葚酒发酵过程中细胞数量、基质及产物的变化

按照1.2.2所示的发酵条件对桑葚酒进行发酵，并对发酵过程中的酵母数量、还原糖及乙醇体积分数进行测定，结果见图2。由图2可知，在0～8 h，糖含量由200.00 g/L减少为196.70 g/L，乙醇体积分数增加至0.2%，由于初始糖含量浓度较高，对酵母具有抑制作用，同时酵母处于适应期，此时乙醇生成量、糖消耗量几乎无变化；8～24 h为酵母对数生长期，酵母数量由0.45×108CFU/mL迅速增加至2.55×108CFU/mL，糖含量由196.70 g/L降解为134.64 g/L，乙醇体积分数由0.22%增加为3.07%，酵母利用碳源合成自身物质的同时，部分用于代谢生成乙醇，糖消耗急剧增加，乙醇的生成随着酵母的生长而增加；酵母生长进入稳定期后，其数量保持在2.83×108CFU/mL左右，发酵至100 h时，糖含量降为3.86 g/L，酒精含量为9.01%，此时酵母生长与死亡保持动态平衡。整个发酵过程糖醇转化率为46%，结合式(7)及其参数分析可知，理论上每1 L发酵液中108.41 g糖用于合成乙醇，23.92 g糖用于酵母生长，67.67 g糖用于产生能量和风味物质。

图1 乙醇体积分数标准曲线和葡萄糖标准曲线

图2 桑葚果酒发酵过程中主要指标变化

Figure 2 The metabolic curves of fermentation process of Mulberry wine

由图3可知，酵母生长速率在16 h左右达到最大，乙醇生成速率在48 h左右达到最大，乙醇最大生成速率出现晚于酵母最大生长速率，表明乙醇生成与细胞生长是部分偶联型；糖消耗速率出现两个最高峰，分别是酵母生长率最大时和乙醇产率最大时，表明基质的消耗过程主要用于酵母生长繁殖和代谢生成乙醇；在75 h以后，残糖含量降低至5.4 g/L，乙醇体积分数为8.5%，酵母细胞2.84×108CFU/mL，基质消耗速率趋于平稳但不为零，表明此时糖的消耗主要不是用于乙醇生成，结合实际分析，有可能为维持酵母细胞代谢和生成芳香类物质。

2.3 模型参数求解

2.3.1 菌体生长动力学模型求解 根据试验数据，利用origin 9.0软件对数据进行分析并拟合，其结果见图4；参数预测结果为x(0)=0.030×108CFU/mL，xm=2.836×108CFU/mL，μm1=0.274h-1，由非线性回归和方差分析可知，R2=0.974，说明该模型能较好地模拟并预测酵母菌体生长的动态变化过程，将拟合值代入式(3)得模型方程：

图3 桑葚果酒发酵过程中物质变化速率

Figure3Changesintherateofalcoholproduction,cellgrowthandinitialsugarconsumption

图4 菌体生长真实值与预测值模型拟合曲线

Figure4Fittingcurveofactualvaluesandpredictivevaluesforcellgrowth

(8)

由图4可知，拟合曲线初期与真实值差距较大，在对数生长期具有较高的拟合度。在0～4 h，酵母处于适应期，同时由于底物浓度的抑制作用，生长缓慢；在8～24 h，酵母处于对数生长期，此时发酵过程主要以酵母生长为主，伴有少量乙醇生成；当酵母进入稳定期，发酵罐中活菌数量保持动态平衡，此时发酵罐内主要进行产物生成过程，此时酵母细胞的抑制以产物抑制为主。

2.3.2 产物生成动力学模型求解 根据测定样品中乙醇与正丁醇的比值，得出不同发酵时间的发酵液中乙醇体积分数，并利用origin 9.0软件对其进行非线性拟合，结果见图5。拟合结果显示，pm=8.941%，p0=0.329%，μm2=0.095h-1，方差分析R2=0.988，该方程能较好的拟合酵母乙醇生成曲线。将所求参数代入式(5)，得：

(9)

由图5可知，在发酵中期和后期产物的真实值与预测值均有较好的拟合度，乙醇生成动力学模型能较好地反应发酵过程中乙醇的变化情况。

图5 产物生成真实值与预测值模型拟合曲线

Figure 5 Fitting curve of actual values and predictive values for alcohol production

(10)

拟合曲线见图6。由图6可知，在12～64h时，糖含量真实值与预测值较吻合。在发酵前期和后期，真实值与预测值有一定偏差，可能是发酵前期测量误差导致的糖含量略微偏高，后期由于底物含量呈降低趋势但不明显，故导致方程拟合时误差较大，总体上该动力学模型能较好的反映桑葚酒发酵过程中基质消耗的过程。

图6 底物消耗真实值与预测值模型拟合曲线

Figure6Fittingcurveofactualvaluesandpredictivevaluesforsubstrateconsumption

2.3.4 模型验证 为验证模型可靠性，取250mL桑葚汁调整初始含糖量为200g/L，接种5%活化酵母后28 ℃恒温发酵100h，每隔4h取样测定其糖含量、乙醇体积分数、细胞含量，将模型预测值与实际值作对比，结果见表2。由表2可知，酵母数量模型预测值与实测值相对偏差仅为5.90%，乙醇体积分数相对偏差为7.05%，残糖含量相对偏差为3.38%，说明模型方程能较好地反应发酵过程中酵母数量、乙醇体积分数和残糖含量的变化过程,该模型参数对指导桑葚果酒发酵具有实际意义。

表2 模型预测值与实际值数据对比

3 结论

桑葚果酒酿造试验中，在初始糖含量为200g/L条件下，接种5%活化酵母置于28 ℃恒温培养，发酵100h后乙醇含量为9.01%，残糖含量3.86g/L，酵母数量2.83×108CFU/mL。发酵8h时酵母进入对数生长期，24h后进入稳定生长期，随着酵母生长乙醇产生，发酵至72h后糖含量减少缓慢，乙醇体积分数保持稳定，主发酵基本结束。应用Logistic模型方程，建立桑葚果酒酿造过程中菌体生长、底物消耗、产物生成的动力学模型，通过origin9.0软件对方程进行非线性回归及方差分析，得出模型预测值与实际值数据拟合R2分别为0.974，0.988，0.991，具有较高的拟合度，表明试验所求动力学能较好地反应桑葚果酒发酵过程中菌体数量、底物消耗、产物生成的动态变化过程。

发酵动力学对工业化生产控制提供依据，本试验探究的是桑葚汁含量较少情况下果酒酿造过程，其温度、溶氧等条件易于控制，当发酵进入工业化生产，由于发酵体积增大，机械搅拌、温度控制、泡沫等条件的共同作用，对酵母生长和代谢具有极大影响，发酵动力学相关参数的确定会有所不同[18]，因此，要建立适合于工业化控制的发酵动力学过程，需在工业化生产过程中进行相关研究，建立特定发酵条件的发酵动力学模型。

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The batch fermentation kinetics of mulberry fruit wine

HU Yong-zheng LI Ming-yuan LI Mei DING Wen-wu KANG Ling WANG Chong CHEN Jian-hua LI Chun-mei

(SchoolofFoodandBioengineering,XiHuaUniversity,Chengdu,Sichuan610039,China)

The laws of cell growth, product formation and substrate consumption during mulberry wine fermentation were studied with mulberry juice. The kinetic models were established throughLogisticmodel equation to fit the curves of cell growth, product formation and substrate consumption. The results showed as follows: When the initial sugar concentration was 200 g/L, the inoculation of activated yeast was 5%, and the fermentation time lasted for 100 h at 28 ℃, the residual sugar concentration of fermentation broth decreased to 3.86 g/L, the number of yeast increased to 2.83×108CFU/mL and the ethanol concentration reached 9.01%. The models fitted well for cell growth, product formation and substrate consumption. TheR2of models was 0.974, 0.988 and 0.991 respectively. Meanwhile, the models could reflect and predict the fermentation process of mulberry wine well.

mulberry; fruit wine; fermentation; kinetics

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.12.002

四川省科技支撑项目(编号：2015NZ0007)

胡永正，男，西华大学在读硕士研究生。

李明元(1965-)，男，西华大学教授，硕士。 E-mail: limingyuan519@qq.com

2016—10—12