中高温大曲中一株耐热细菌的分离鉴定及其风味代谢产物分析

周 平,罗惠波,2,*,黄 丹,邓 波,王 庆,黄治国,2,卫春会,2,邓 杰,2

(1.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000;2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡 643000;3.泸州老窖股份有限公司,四川泸州 646000;4.国家固态酿造工程技术研究中心,四川泸州 646000;5.长江师范学院生命科学系,重庆 408100)

中高温大曲中一株耐热细菌的分离鉴定及其风味代谢产物分析

周 平1,罗惠波1,2,*,黄 丹1,邓 波3,4,王 庆5,黄治国1,2,卫春会1,2,邓 杰1,2

(1.四川理工学院生物工程学院,四川自贡 643000;2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室,四川自贡 643000;3.泸州老窖股份有限公司,四川泸州 646000;4.国家固态酿造工程技术研究中心,四川泸州 646000;5.长江师范学院生命科学系,重庆 408100)

目的:以培菌完成的中高温大曲为样品,分离鉴定耐热细菌并对其风味代谢产物进行分析。方法:通过富集培养和稀释涂布分离、形态学观察及16S rDNA序列分析、生长特性分析,并采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对其固态和液态发酵产物进行分析。结果:筛选出一株耐热能力较好的细菌NR2,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis);该细菌培养第4 h开始进入对数生长期,培养24 h达稳定期;液态发酵可以产2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇等风味物质,其中3-羟基-2-丁酮为主要代谢产物;固态发酵代谢产物种类要高于液态发酵,主要是2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等吡嗪类化合物含量增加。结论:曲香的形成及浓香型白酒风味物质的形成与耐热细菌NR2的代谢特性有关。

大曲,耐热细菌,分离,鉴定,代谢产物,地衣芽孢杆菌

4.National Engineering Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou 646000,China;

5.Department of Life Science,Yangtze Normal University,Chongqing 408100,China)

浓香型白酒是我国三大基本香型白酒之一,具有酒香浓郁、口味浓醇、香味协调的特征,深受广大饮酒消费者的喜爱[1]。而中高温大曲作为酿造浓香型白酒的糖化发酵剂,含有细菌、霉菌、酵母等多种微生物,这些微生物在浓香型白酒的酿造过程中共酵生成复杂的白酒成分,赋予了浓香型白酒独特的风格特征[2]。在中高温大曲制曲培菌过程中,最高品温可达到62 ℃左右,这种中高温制曲的工艺既保留了大量中温微生物,还富集了大量耐热微生物,使耐热细菌成为中高温大曲中一类重要的优势功能菌[3-5]。研究发现,耐热细菌能够代谢3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇以及吡嗪类等香味物质,且能够产生多种淀粉酶、蛋白酶等多种酶类,推动着各种生化反应的进行[4,6-7]。白酒风味的形成与耐热细菌关系密切,白酒典型风格及特征是大曲中耐热功能细菌作用的重要体现[8]。

对此,我国白酒生产厂家和部分科研院所对这类耐热微生物进行了积极的探索,尤其以酱香型高温大曲中耐热微生物的研究最多。周瑞平等[9]从偏高温大曲中分离筛选出一株能耐70 ℃左右的细菌,经鉴定为Lysini bacillus属微生物,为解析多粮浓香型白酒酒体形成原因提供了一定的理论基础;王勇等[10]从浓香型白酒大曲中筛选出8株优势芽孢杆菌,经细菌脂肪酸鉴定技术(MIDI鉴定系统)确定为分属于5个种。连宾等[11]从茅台酒曲分离出多株嗜热细菌,并发现枯草芽抱杆菌群是形成酱香型白酒独特风格的重要菌类。余婷婷等[12]对高温大曲中产酱香耐高温细菌进行了筛选,并初步鉴定为地衣芽胞杆菌,同时发现该菌株发酵能产生酱香型白酒固有的酱香味道。葛媛媛等[13]研究了芝麻香型白酒高温大曲的嗜热细菌群落结构,通过55 ℃高温筛选获得的85株嗜热细菌,为探索形成芝麻香型白酒典型性风格的机理奠定了基础。

为研究中高温大曲中耐热细菌与浓香型白酒特征风味物质之间的联系,本论文以培菌完成的中高温大曲为样品,通过富集培养和稀释涂布分离得到一株耐热能力较好的芽孢杆菌,并通过纯种液态和固态发酵,对其风味代谢产物进行分析。为研究中高温大曲中耐热细菌的功能特性以及对浓香型白酒的贡献提供实验依据,为进一步揭示浓香型白酒典型风格与大曲耐热细菌的相关性以及通过调控耐热细菌代谢进而提高浓香型白酒品质具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中高温大曲 泸州老窖制曲生态园;细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;麸皮固体培养基 麸皮99 g,葡萄糖1 g,水70 mL;小麦固体培养基 小麦100 g,水100 mL;麸皮浸出液培养基 麸皮100 g,α-淀粉酶2000 IU,水500 mL,静止10 min后,加入碱性蛋白酶100000 IU,于55 ℃保持30 min,过滤取上清液;小麦浸出液培养基 小麦100 g,α-淀粉酶2000 IU,水500 mL,静止10 min后,加入碱性蛋白酶100000 IU,55 ℃保持30 min,过滤取上清液。

Agligent7890A-5975B气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司;LS-I201型生化培养箱飞世尔实验器材(上海)有限公司;HT300A系列自动固相微萃取仪 意大利HTA公司;Thermo1500全波长酶标仪 美国赛默飞世尔科技公司;Leica DM300型正置显微镜 徕卡仪器(德国)有限公司;Starter2100 pH仪 奥豪斯仪器(常州)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 耐热细菌的分离及纯化 在无菌条件下,取中高温大曲25 g,加入225 mL生理盐水中,然后在150 r/min转速下混匀30 min后置于80 ℃水浴1 h;在水浴过后的曲液中取4 mL接种装有50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL的三角瓶中于55 ℃富集培养24 h。

初筛:从富集培养过后的发酵液中吸取1 mL发酵液加入装有9 mL生理盐水的试管中稀释10倍,然后逐级稀释成102、103、104、105倍。吸取100 μL稀释105倍后的发酵液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上,55 ℃倒置培养24 h,观察菌落特征,选取差异明显的菌落进行纯化,4 ℃保存备用。

复筛:将分离纯化的耐热细菌接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中,振荡均匀后放入恒温培养摇床中以120 r/min,55 ℃培养18 h,以8%的接种量接种于小麦固体培养基中45 ℃培养4 d。请10名进行过闻香训练的专业人员按酯香味(0～5分)、酸味(0～5分)、酱香味(0～5分)三种香味的强弱对产香情况进行综合感官评定打分,选取能耐热且产香突出的菌株作为出发菌株。

1.2.2 耐热细菌的形态及生长特性 将分离纯化后的耐热细菌进行革兰氏染色,通过光学显微镜进行观察,对细菌的形状、大小等进行记录。

将耐热细菌从斜面上取一接种环接入液体牛肉膏蛋白胨培养基中,置于45 ℃,120 r/min下培养,每隔2 h通过酶标仪测定在600 nm波长下发酵液的OD值,以培养时间为横坐标、OD值为纵坐标,绘制生长曲线。

1.2.3 耐热细菌的鉴定 使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取耐热细菌的基因组DNA,以细菌的基因组DNA为模板,用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R作为上下游引物进行PCR扩增。PCR扩增体系和PCR反应条件按照参考文献[14]进行,然后将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,条件为80 V,60 min,Marker为DL2000,并将PCR产物送至上海杰李生物技术公司测序,测序结果上传到EzTaxon数据库中,然后在ezbiocloud网站进行Identifying搜索,比较所测得的序列与所有已测定的序列,利用MAGE6.06中的Clustal X进行多序列比对,用NJ法/邻接法(Mega软件)构建系统发育树,初步确定耐热细菌的系统发育地位。

1.2.4 耐热细菌液态发酵与固态发酵[15]种子液的制备:在斜面保存的菌落中取一环耐热细菌接入装有50 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中,振荡均匀后放入恒温培养摇床中以120 r/min,45 ℃培养18 h得种子液。

液态发酵:培养好的种子液,以8%的接种量分别接种于装有50 mL麸皮浸出液培养基和小麦浸出液培养基中,以不加种子液的两种浸出液培养基为空白对照,40 ℃,120 r/min振荡培养4 d。

固态发酵:培养好的种子液,以8%的接种量分别接种于装有30 g麸皮固体培养基和50 g小麦固体培养基的三角瓶中,以不加种子液的两种固体培养基为空白对照,40 ℃恒温培养4 d。

1.2.5 风味代谢产物检测[16]固相微萃取条件:精确量取4 mL液态发酵样品(或4 g固体发酵样品)于顶空瓶中,将顶空瓶放入全自动固相微萃取仪中,65 ℃平衡10 min后再萃取30 min。

气相色谱条件:DB-WAX 60.0 m×0.25 mm×0.25 μm毛细管色谱柱;进样口温度230 ℃;不分流;程序升温:40 ℃保持1 min,5 ℃/min升到180 ℃用于1 min,再以8 ℃/min升到230 ℃保持7 min;载气:99.999%氦气,载气流速:1 mL/min。

质谱条件:电离电压70 eV,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,电离方式EI,质量扫描范围20～500 amu,溶剂延迟3 min。

1.3 数据处理

文中生长曲线图示采用origin作图,测定结果以平均值±标准偏差表示;采用Mega6.06软件进行菌株系统发育树的建立;GC-MS数据利用NIST数据库和RTLPEST数据库进行比对分析出物质种类,并采用面积归一化法进行定量分析,根据某一物质的色谱峰面积与总峰面积的比值求出其相对百分比含量值。

2 结果与分析

2.1 耐热细菌的分离筛选与观察

从中高温大曲中成功分离纯化出4株耐热细菌,编号为NR1～NR4;其综合感官评定总分值分别为3、7、5、2分。其中耐热细菌NR2分值最高,特别是酱香味最为突出,故选取NR2为出发菌株,NR2菌落及镜检结果如图1所示。可以看出,细菌NR2在牛肉膏蛋白胨平板上,菌落呈椭圆形,表面光滑,非常湿润,粘稠不易挑起;在油镜下,细胞形态呈长杆状,革兰氏阳性。

图1 菌株NR2菌落形态及革兰氏染色结果Fig.1 colony morphology and gram microscopic examination of the strain NR2

2.2 耐热细菌NR2的生长特性

将耐热细菌NR2在牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养,通过酶标仪在600 nm波长测定耐热细菌生长不同时段OD值如图2所示。细菌NR2培养0～4 h时,OD值几乎没有变化,说明这个时间段细菌NR2菌体生长速率缓慢,为生长迟缓期;从第4 h开始,OD值开始迅速上升,说明细菌NR2生长速度加快,菌体生长进入对数生长期;从第24 h开始,OD值变化趋于平缓,说明细菌NR2菌体量随时间延长而基本保持平衡,菌体生长处于稳定期。

图2 耐热细菌NR2的生长曲线Fig.2 growth curve of the strain NR2

2.3 耐热细菌NR2分子生物学鉴定

2.3.1 耐热细菌NR2的DNA提取及PCR扩增 电泳结果在凝胶成像系统下观察拍照,结果如图3所示。耐热细菌NR2的基因PCR产物与DNA marker 1500 bp的条带基本一致,说明其分子量大约为1500 bp,与预计目标长度相一致,可以将PCR产物被送至测序公司测序。

图3 菌株NR2的16S rDNA PCR扩增产物电泳图Fig.3 16S rDNA PCR amplification electrophoretogram of the strain NR2

2.3.2 耐热细菌NR2的16S rDNA序列测定及分析 PCR扩增产物经上海杰李生物技术有限公司测序,耐热细NR2经测序得到长度为1424 bp的基因片段,将序列上传至EzTaxon数据库,将其与EzTaxon数据库中原有其它细菌的16S rDNA序列进行相似性比较,发现与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、萎缩芽孢杆菌(Bacillusatrophaeus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)都有较高的相似性,其中与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的相似性最高为100%。选取5株相似度较高的菌株序列与NR2用Clustal X进行序列比对,用Mega6.06软件建立系统发育树,如图4所示。

图4 基于16S r DNA序列同源性的菌株NR2的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S r DNA sequence of the strain NR2

从图4可以看出,耐热细菌NR2与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)位于同一分支,同源关系可信度为100%,结果可靠。依据系统发育树的相似性和同源性分析,结合它的形态学特征、革兰氏染色实验结果,耐热细菌NR2被鉴定可能为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。

注:nd代表未检出。2.4 耐热细菌NR2的风味代谢产物分析

2.4.1 耐热细菌NR2液态发酵代谢产物 耐热细菌NR2在麸皮浸出液和小麦浸出液中培养4 d后,采用顶空固相微萃取对其发酵液和空白浸出液进行萃取,然后利用GC-MS对风味物质进行检测。麸皮浸出液和小麦浸出液及耐热细菌NR2发酵液的GC-MS总离子流色谱图如图5、图6所示,挥发性成分与谱库比对结果如表1所示。

图6 小麦浸出液和菌株NR2在小麦浸出液中发酵的总离子流色谱图Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of wheat leaching solution and strain NR2 fermentation in wheat leaching solution

由图5、图6和表1可知,在麸皮浸出液和小麦浸出液中均未检测到挥发性风味物质。耐热细菌NR2在麸皮浸出液和小麦浸出液中发酵所产生的挥发性风味代谢产物种类差异不大,在麸皮浸出液和小麦浸出液中发酵均产生了4种主要的风味物质,其中两种发酵液中共有的物质为2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇。通过峰面积归一法对各化合物成分在发酵液样品中相对含量进行计算,发现3-羟基-2-丁酮在两种发酵液中所占的比例最高,相对含量分别达到了84.162%、90.206%。说明在耐热细菌NR2在麸皮浸出液和小麦浸出液两种液体培养基中发酵的主要代谢产物为3-羟基-2-丁酮。研究表明,3-羟基-2-丁酮对白酒风味的形成起到非常重要的作用,它是生成吡嗪类化合物的前体物质,与其他代谢产物共同作用参与到白酒特征风味物质的形成,特别是为酱香型白酒特征风味香气的形成奠定了基础[17]。

2.4.2 耐热细菌NR2固态发酵代谢产物 耐热细菌NR2在麸皮固体培养基和小麦固体培养基中发酵培养4 d后,采用顶空固相微萃取对发酵后的培养基和空白培养基进行萃取,然后利用GC-MS对风味物质进行检测,GC-MS总离子流色谱图如图7、图8所示,挥发性成分与谱库比对结果如表2所示。

表2 菌株NR2在麸皮和小麦固态培养基中发酵风味物质GC-MS分析结果

图7 麸皮固体培养基和菌株NR2在麸皮固态培养基中发酵的总离子流色谱图Fig.7 GC-MS total ion current chromatogram of bran solid medium and strain NR2 fermentation in bran solid medium

图8 小麦固体培养基和菌株NR2在小麦固态培养基中发酵的总离子流色谱图Fig.8 GC-MS total ion current chromatogram of wheat solid medium and strain NR2 fermentation in wheat solid medium

注:nd代表未检出。

由图7、图8可知,从空白麸皮固体培养基和空白小麦固体培养基中检测到少量挥发性风味物质,消除空白组中的挥发性风味物质后,两种固体培养基发酵后检测出的挥发性风味物质见表2。由表2可知,耐热细菌NR2在以麸皮和小麦为发酵底物进行固态发酵分别检测出6种、7种挥发性风味代谢产物,其中3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二醇在两种固态发酵所产的风味产物中相对含量最高,为耐热细菌NR2在固态发酵中的主要代谢产物。同时可以发现,耐热细菌NR2固态发酵要比液态发酵所产的挥发性风味代谢产物种类要多,主要是吡嗪类物质含量增加。两种固态发酵产物中均检测出三种吡嗪类物质,其中2,3,5-三甲基吡嗪相对含量较其它两种高,吡嗪类化合物是酱香型白酒中特征风味物质,但同时也是浓香型白酒的重要风味物质之一,其对优质酒陈香风味的贡献很大[18]。

耐热细菌NR2在以麸皮和小麦为底物的固态发酵过程较液态发酵更为复杂,从而导致3-羟基-2-丁酮含量降低,而2,3-丁二醇含量上升,而且产生了吡嗪类物质,分析原因可能是在固态发酵过程中3-羟基-2-丁酮在各种酶的作用下通过一系列化学反应转化为2,3-丁二醇和吡嗪类物质。

3 结论

耐热细菌是中高温大曲在培菌过程中非常重要的菌种,为了研究中高温大曲中耐热细菌与浓香型白酒特征风味物质之间的联系,以培菌完成的中高温大曲为样品,通过富集培养和稀释分离得到一株耐热能力较好的细菌NR2,经培养特征形态观察以及16S rDNA序列分析,鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。通过对耐热细菌NR2的生长特性研究发现:NR2从培养第4 h开始进入对数生长期,培养24 h达稳定期;通过对耐热细菌NR2的发酵特性研究发现:耐热细菌NR2在麸皮固体培养基、麸皮液体培养基、小麦固体培养基及小麦液体培养基中发酵培养4 d后,采用顶空固相微萃取和GC-MS对风味物质进行检测,从液态发酵液中检测到2,3-丁二酮、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二醇等风味物质,其中3-羟基-2-丁酮为主要代谢产物;固态发酵所产挥发性风味化合物种类要高于液态发酵,主要是2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等吡嗪类化合物含量增加。

高温转化期是中高温大曲制曲生产中重要工序,在制曲品温升高过程中,绝大多数霉菌死亡,酵母菌数量几乎为零,耐热细菌成为唯一优势菌群;加强对耐热细菌在白酒酿程中产酶及风味代谢的研究,不仅有利于用科学方法和原理指导生产、改进白酒生产工艺,同时还可以为进一步阐明白酒典型风格特征的形成机理奠定基础,从而可以提高酒体的质量。

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Separation and identification of thermoduric bacteria strains in medium/high temperature Daqu and the analysis of the flavor metabolites

ZHOU Ping1,LUO Hui-bo1,2,*,HUANG Dan1,DENG Bo3,4,WANG Qing5, HUANG Zhi-guo1,2,WEI Chun-hui1,2,DENG Jie1,2

(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science & Engineering,Zigong 643000,China; 2.Liquor Making Bio-Technology & Application of Key Laboratory of Sichuan Province,Zigong 643000,China; 3.Luzhou Laojiao Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China;

Objective:With the medium/high temperature Daqu bacteria through cultivation as examples,separation of thermoduric bacteria and the analysis of the flavor metabolites. Method:Isolated via enrichment culture and dilution coating,the morphological observation and 16S rDNA sequence analysis,growth characteristics analysis,the solid and liquid fermentation products were analyzed through headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry technology. Result:The thermoduric bacteria strain NR2 was isolated and it wasBacilluslicheniformis,the bacteria culture began to enter the logarithmic phase from the 4 h of cultivation and reached the stable phase after 24 h of cultivation,the liquid state fermentation flavor substances,such as 2,3-diacetyl,3-hydroxy-2-butanone and 2,3-butanediol,with 3-hydroxy-2-butanone being the main metabolites. In addition,there were more species of solid state fermentation metabolites that liquid ones. The contents of pyrazine compounds,such as 2,3,5-methyl pyrazine and 2,3,5,6-tetramethyl pyrazine increased.Conclusion:The formation of liquor and highly-flavored liquor flavor substances was closely related to the metabolic characteristics of the thermoduric bacteria.

Daqu;thermoduric bacteria;separation;identification;metabolites;Bacilluslicheniformis

2016-06-15

周平(1993-),男,硕士研究生,研究方向:酿酒生物技术及应用,E-mail:zhouping19930408@163.com。

*通讯作者:罗惠波(1969-),男,教授,研究方向:酿酒生物技术及应用,E-mail:sgxlhb@suse.edu.cn。

国家固态酿造工程技术研究中心项目(2015K-245);重庆市社会事业与民生保障科技创新专项(cstc2015shmszx80025)。

TS

A

1002-0306(2016)24-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.24.000